Klotho基因及其多態(tài)性的研究進(jìn)展

孟慶玲 黃 曙 范志寧

(南京浦口醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 南京 210031)

Klotho基因是 Kuro等〔1〕于 1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因,并用古希臘神話(huà)中紡織生命之線(xiàn)女神的名字命名。Klotho基因被敲除的小鼠(KL-/-小鼠)可出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)衰老的各種表型,如壽命縮短、不育癥、動(dòng)脈硬化、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松、肺氣腫等。近年來(lái)對(duì)klotho基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系逐漸受到重視,現(xiàn)將有關(guān)研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 Klotho基因的結(jié)構(gòu)

Klotho基因長(zhǎng) 50 kb,由 5個(gè)外顯子和 4個(gè)內(nèi)含子組成〔2,3〕。人的 klotho基因位于 13q12,klotho基因的操縱子內(nèi)沒(méi)有 TATA盒和 CAAT盒,但有 5個(gè)潛在的 SP1結(jié)合位點(diǎn),外顯子1及旁側(cè) 2 000 bp序列中,G+C的平均含量為 66.75%,最高達(dá)到 98%,提示在這一區(qū)域有 CpG島的存在〔1,4〕。在 klotho基因結(jié)構(gòu)中,其RNA存在著一個(gè)潛在的可變剪切位點(diǎn),這一位點(diǎn)如果接受了一個(gè) 50bp片段的插入,該插入序列末尾的兩個(gè)核苷酸TA就會(huì)與外顯子 4的第一個(gè)核苷酸G共同構(gòu)成一個(gè)終止密碼 TAG,使得RNA由此截?cái)嘈纬梢粋€(gè)短的開(kāi)放閱讀框,僅含3個(gè)外顯子和 2個(gè)內(nèi)含子而編碼分泌型klotho蛋白。但如果可變剪切位點(diǎn)沒(méi)有 50bp片段的插入,其RNA就是一個(gè)完整的結(jié)構(gòu),包括 5個(gè)外顯子和 4個(gè)內(nèi)含子,編碼形成一種膜型 klotho蛋白。人的膜型 klotho cDNA全長(zhǎng) 3 036 bp,分泌型 cDNA全長(zhǎng)1 647 bp。膜型klotho基因表達(dá)的膜型蛋白是一種單跨膜蛋白,包括一個(gè)N端信號(hào)序列、帶有兩個(gè)內(nèi)部重復(fù)片段的KL1和KL2細(xì)胞外區(qū)域,一個(gè)單跨膜區(qū)和一個(gè)短的胞內(nèi)區(qū)。在KL1和KL2之間有一段 Lys-Lys-Arg-Lys的堿性氨基酸序列,可能為蛋白酶裂解位點(diǎn),該位點(diǎn)有時(shí)可能被裂解,釋放出小肽而作為體液因子發(fā)揮作用。而分泌型 klotho基因表達(dá)的分泌型蛋白由于可變剪切的原因,僅含有 N端序列和 KL1胞外區(qū),缺少了KL2胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。人的膜型蛋白含有 1 012個(gè)氨基酸,分泌型蛋白含有 549個(gè)氨基酸。

2 Klotho基因多態(tài)性

Klotho基因共含有 400多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs),其中影響轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的主要是啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)的 SNPs,其中啟動(dòng)子區(qū)有 16個(gè) SNPs,5個(gè)外顯子區(qū)共有 15個(gè) SNPs,其余均在內(nèi)含子內(nèi)。目前研究最多的是 KL-VS〔5〕,包含 6個(gè)SNPs,位于外顯子 2區(qū)附近,3個(gè) SNPs在外顯子 2區(qū)內(nèi),其中 1個(gè)為無(wú)義突變,另兩個(gè) F352V(A1056G)和 C370S(G1110C),這 6個(gè)SNPs處于完全連鎖不平衡。KL-VS具有明顯的種族特異性,白種人群有 20% ～31%的變異〔5,6〕,而日本和韓國(guó)等亞洲人群未發(fā)現(xiàn)變異〔7,8〕。其他如啟動(dòng)子-395也存在 G-A變異,在正常人群中 G、A的頻率分別為 80.4% ～85.7%和 14.3% ～19.6%〔7,9,10〕。 該等位基因是 Kawano等〔8〕在研究絕經(jīng)后婦女骨密度時(shí)發(fā)現(xiàn),電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)顯示 G→A替換后 DNA蛋白復(fù)合物的量明顯下降,推測(cè)該替換可能通過(guò)減少蛋白和klotho基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而改變klotho基因表達(dá)。外顯子 4區(qū)的 C1818T(His→His)的變異,并不能引起氨基酸表達(dá)的改變,但可能也與某些疾病有關(guān),多項(xiàng)研究表明〔11,12〕外顯子區(qū)的無(wú)義突變也可能產(chǎn)生有異常功能的多種轉(zhuǎn)錄或影響產(chǎn)物的表達(dá)水平,Kawano等〔8〕用 RT-PCR方法沒(méi)有發(fā)現(xiàn) C1818T變異引起的 klotho基因轉(zhuǎn)錄的變化,推測(cè)C1818T位點(diǎn)可能與影響klotho基因功能的一個(gè) SNP位點(diǎn)有機(jī)聯(lián)系在一起。在正常人群中 C、T的頻率分別為 58.9% ～81.9%和 18.1% ～41.1%〔7,10〕。 klotho基因其他 SNPs如啟動(dòng)子區(qū) G-959C、外顯子 1區(qū) A44C和 C234G、外顯子 4區(qū) C2298T等,因未發(fā)現(xiàn)與疾病有關(guān)或小等位基因頻率低于5%,在此不再贅述。

3 Klotho基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

3.1 Klotho基因與心血管疾病 Klotho基因缺陷的小鼠在出生 4 w后即可出現(xiàn)動(dòng)脈硬化,并隨著年齡的增加而加重,這些血管變化與人類(lèi)動(dòng)脈硬化非常相似。把外源性正常klotho cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給 klotho基因缺陷的小鼠后,其動(dòng)脈硬化程度可得到顯著改善〔1〕,由此推測(cè)在人體也可能存在 klotho基因突變或有特定的 klotho等位基因與動(dòng)脈硬化密切相關(guān)。為此,Arking等〔13〕檢測(cè)了兩組相互獨(dú)立的無(wú)癥狀冠心病患者的KL-VS等位基因頻率,同時(shí)比較冠心病的危險(xiǎn)因素如血糖、血脂、血壓、體重指數(shù)、吸煙情況,經(jīng)過(guò) Logistic回歸分析,證實(shí) KL-VS等位基因是早發(fā)冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨后他們〔14〕又檢測(cè)了 525例北歐猶太教徒的 KL-VS等位基因頻率,并用多元回歸法分析KL-VS基因型與血壓、血脂等心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)HDL-C和收縮壓與 KL-VS具有相關(guān)性,野生型(FF)和 KL-VS純合型(VV)與雜合型(FV)相比,HDL-C分別下降了 3.47和9.80mg/dl,收縮壓升高 6.51和 18.97mmHg,提示 KL-VS純合型患心血管疾病的危險(xiǎn)度最高。用 Cox回歸分析,KL-VS純合型和野生型較雜合型相對(duì)危險(xiǎn)度提高了 4.49和 2.15倍。以上報(bào)道均提示 KL-VS基因與心血管疾病密切相關(guān)。除 KL-VS基因外,在亞洲地區(qū)也進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)G-395A與心血管疾病關(guān)系的研究其關(guān)系目前尚不明確。Imamura等〔9〕認(rèn)為冠狀動(dòng)脈狹窄患者 klotho基因-395A等位基因頻率(29.9%)明顯高于對(duì)照組(19%),調(diào)整后的 P=0.029,而冠狀動(dòng)脈痙攣組(23.4%)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異,從而推測(cè)-395A可能是冠心病獨(dú)立的基因危險(xiǎn)因子。而 Rhee等〔15〕在對(duì) 274例因胸痛進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影檢查的韓國(guó)人 G-395A分型中發(fā)現(xiàn),冠心病患者攜帶 A等位基因(GA+AA)的頻率(45.1%)與非冠心病患者(54.9%)相比,兩者無(wú)顯著差異(P=0.746),目前-395A等位基因是否是冠心病篩選基因還有待大樣本進(jìn)一步證實(shí)。

3.2 Klotho基因與骨質(zhì)疏松 人的骨質(zhì)密度是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果,實(shí)際上 Ralston等〔16〕認(rèn)為基因在骨質(zhì)密度方面可能起到 50%～80%的作用,而且不同基因在不同年齡階段起著不同作用。由于 KL-/-小鼠可出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)衰老的各種表型,包括骨質(zhì)疏松,由此推測(cè) klotho基因多態(tài)可能與骨質(zhì)疏松有關(guān)。Kawano等〔8〕研究報(bào)道在 55例≥65歲絕經(jīng)期婦女的小樣中提示 klotho基因可能與衰老有關(guān)的骨質(zhì)疏松有關(guān)。Mullin等〔17〕報(bào)道與此相反,他們檢測(cè) 1 190例白種人絕經(jīng)期婦女基因型及其各部位(包括髖骨、股骨頸、股骨粗隆和粗隆間)的BMD和其中 200例降鈣素,發(fā)現(xiàn) G-395A和 C1818T兩基因多態(tài)與各部位的 BMD無(wú)關(guān),而C1818T多態(tài)與血清降鈣素有關(guān),TT型的降鈣素明顯大于 CT型,CT型大于 TT型。以上報(bào)道存在矛盾之處,提示G-395A和C1818T多態(tài)與人體骨質(zhì)密度(BMD)可能無(wú)關(guān),還有待進(jìn)一步研究。在T352V與BMD的關(guān)系方面,Zarrabeitia等〔18〕檢測(cè) 362位西班牙男性的 F352V基因型和各部位(包括腰椎、股骨頸、髖骨和跟骨)的BMD,362位男性作為整體,FV+VV基因型的 BMD與FF的無(wú)明顯區(qū)別,≤53歲的中青年人群中,FV+VV基因型的 BMD明顯高于 FF基因型的。Riancho等〔10〕則認(rèn)為女性的 F352V基因型和 BMD的關(guān)系與絕經(jīng)狀態(tài)有關(guān),絕經(jīng)前F352V基因型和BMD無(wú)關(guān),絕經(jīng)后含F(xiàn)V+VV基因型的婦女BMD較含 FF基因型的高。由此推測(cè)F352V多態(tài)與BMD可能有一定的關(guān)系。FF基因型可能是骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素。

3.3 Klotho基因與糖代謝 由于 KL-/-小鼠血糖和胰島素水平下降且胰島素敏感性增加,相反,klotho過(guò)表達(dá)的小鼠胰島素抵抗,推測(cè) klotho基因可能與糖尿病有關(guān)。Rhee等〔19〕檢測(cè) 251例健康韓國(guó)婦女快速血糖和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)并用RT-PCR檢測(cè) klotho基因型,發(fā)現(xiàn) G-395A與血糖無(wú)關(guān),而C1818T與血糖有關(guān),含T等位基因血糖高于 C等位基因,HOMA-IR平均值也明顯增高,提示klotho基因可能是研究糖代謝的候選基因之一。Graham等〔20〕在對(duì) 1 793例無(wú)糖尿病家族史的 2型糖尿病患者、1 619例正常對(duì)照和來(lái)自 509例2型糖尿病家庭的 1 616例個(gè)體進(jìn)行 klotho基因 F352V檢測(cè),證明糖尿病患者 FV+VV基因型(28%)與正常對(duì)照(28%)無(wú)顯著差異,用FBAT軟件進(jìn)行家系關(guān)聯(lián)性分析,發(fā)現(xiàn)V等位基因與糖尿病并無(wú)明顯關(guān)聯(lián),提示在大型病例-對(duì)照研究和家系研究中并未發(fā)現(xiàn) klotho基因 F352V與 2型糖尿病有關(guān)。

3.4 Klotho基因與腫瘤 Klotho的功能目前研究較多的是:①klotho蛋白抑制氧化應(yīng)激、提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力〔21〕;②抑制參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的 IGF-1R的作用〔22～25〕;③klotho基因缺乏的小鼠具有免疫抑制作用〔1,26〕。以上均提示klotho可能是一個(gè)腫瘤抑制因子〔27〕。 Wolf等〔28〕在研究 klotho蛋白的表達(dá)與肺癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn) klotho表達(dá)在正常肺組織較肺癌組織高,在癌組織中,癌塊較小的肺癌組織 klotho表達(dá)較較大的肺癌組織高,Wolf等的結(jié)論證實(shí) klotho可能是一個(gè)腫瘤抑制因子。然而 Lingeng等〔29〕在研究卵巢癌與 klotho蛋白表達(dá)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)卵巢上皮細(xì)胞癌組織 klotho蛋白表達(dá)較正常組織增高,klotho表達(dá)可能與卵巢癌的進(jìn)展有關(guān),這一結(jié)論與Wolf等結(jié)果相矛盾。klotho蛋白與腫瘤的關(guān)系還待進(jìn)一步研究。我們〔30〕在研究 klotho基因多態(tài)與胃癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)胃癌患者-395A明顯高于正常對(duì)照,這是首次關(guān)于 klotho基因多態(tài)與腫瘤關(guān)系的研究。

4 展 望

Klotho是與衰老有關(guān)的新基因,目前其多態(tài)性與疾病易感性的研究主要集中在心血管、骨質(zhì)疏松和糖代謝方面的研究,而與腫瘤和免疫功能關(guān)系的研究較少。有關(guān)klotho基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系研究也應(yīng)考慮這些方面。klotho基因功能與各種老年性疾病關(guān)系的研究幫助我們闡明衰老的分子機(jī)制及內(nèi)在本質(zhì),為更好防治衰老性疾病、延長(zhǎng)人類(lèi)壽命奠定基礎(chǔ)。

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