負(fù)載肝癌抗原樹突細(xì)胞瘤苗對癌細(xì)胞免疫抑制作用

馬玉強 張明輝

(唐山市人民醫(yī)院腫瘤醫(yī)院,河北 唐山 063000)

樹突細(xì)胞(DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細(xì)胞,在機體抗腫瘤免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),將腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞分離后在體外采用相關(guān)的細(xì)胞因子進行活化,然后加入自體肝癌細(xì)胞裂解物致敏,將致敏的DC與自體 T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后,誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)免疫,發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)〔2〕。DC瘤苗抗腫瘤研究正成為腫瘤生物學(xué)治療的新熱點。近期研究表明,腫瘤患者DC免疫功能低下〔3〕。如果制備 DC瘤苗回輸患者體內(nèi),可激發(fā)針對肝癌抗原細(xì)胞的 T淋巴細(xì)胞免疫,有望在肝癌術(shù)后的治療中發(fā)揮作用。為此,我們應(yīng)用肝癌細(xì)胞裂解物致敏的DC瘤苗,觀察刺激術(shù)后與術(shù)前自體T淋巴細(xì)胞增殖能力及抑制腫瘤細(xì)胞免疫作用的情況,為肝癌 DC瘤苗用于肝癌患者術(shù)后的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2007年 10月至 2008年 9月唐山市人民醫(yī)院收治的肝癌患者 8例,均無遠處轉(zhuǎn)移灶,無嚴(yán)重臟器功能不全,術(shù)后病理活檢為肝細(xì)胞性肝癌。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞及其裂解物的制備 將手術(shù)切除的肝癌組織剪碎,經(jīng)膠原酶Ⅳ、DNA酶消化后制成細(xì)胞懸液,用 100%和75%的淋巴細(xì)胞分離液分離,收集管底的肝癌細(xì)胞,將 5×106自體肝癌細(xì)胞在-70℃和 37℃下,反復(fù)凍融、篩網(wǎng)研磨、離心和經(jīng)超聲破碎,取上清液經(jīng) 0.2μm濾膜過濾即為肝癌細(xì)胞裂解物,凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DC體外培養(yǎng)、擴增及鑒定 取肝癌患者術(shù)前與術(shù)后外周血各 50ml,肝素抗凝,常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),放置 37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng) 2 h后,吸出未貼壁細(xì)胞,留下貼壁細(xì)胞,加入含 rhGM-CSF 1 000 U/ml和 rhIL-4 500U/ml等細(xì)胞因子的培養(yǎng)液,隔日加細(xì)胞因子(首次濃度的 1/2)和培養(yǎng)基,培養(yǎng) 7d收集的細(xì)胞即為樹突狀細(xì)胞。

1.2.3 肝癌細(xì)胞裂解物致敏DC的制備 在肝癌患者外周血DC體外培養(yǎng)的第 6天,加入肝癌細(xì)胞裂解物(120μg/ml)共培養(yǎng),過夜收獲貼壁的細(xì)胞即為致敏DC瘤苗。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞制備 取肝癌患者術(shù)前與術(shù)后外周血各100ml,分離PBMC,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 3h,去除貼壁細(xì)胞,非貼壁細(xì)胞用含 5%AB型血清的 RPMI1640懸浮,注入尼龍毛柱,37℃孵育 1h,沖洗出非黏附細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞。

1.2.5 肝癌DC瘤苗對自體T淋巴細(xì)胞增殖的影響 收集誘導(dǎo)第 8天的術(shù)前負(fù)載肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗,調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105/ml,加入絲裂霉素 C 25μg/ml,37℃孵育 45 min,PBS洗 3次,完全培養(yǎng)基懸浮,然后與術(shù)前自體 T淋巴細(xì)胞(1×106細(xì)胞 /孔)按 1∶10的比例混合,鋪 96孔培養(yǎng)板(200μl/孔),同時設(shè)自體 T淋巴細(xì)胞(106細(xì)胞/孔)對照,置 37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng) 48h,加入 MTT(5 mg/ml)10μl繼續(xù)培養(yǎng) 8 h。輕輕吸棄培養(yǎng)上清,加入 DMSO 100μl/孔,于 570nm處測定 A值。按公式計算 T淋巴細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞增殖指數(shù);同理,再將收集培養(yǎng)的術(shù)后肝癌DC瘤苗與術(shù)后提取的自體T淋巴細(xì)胞按以上實驗操作,計算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)(%)=實驗組 A值/對照組 A值(%)。

1.2.6 肝癌DC瘤苗刺激自體 T淋巴細(xì)胞分化為CTL及CTL對自體腫瘤細(xì)胞殺傷活性檢測 于 6孔板中加入術(shù)前自體 T淋巴細(xì)胞(1×106細(xì)胞/孔)、術(shù)后肝癌 DC瘤苗(1×105細(xì)胞/孔)以及 IL-2 200U/ml,置 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)的第 3、6天換液、擴增,收集第 4～6天培養(yǎng) 72h的上清備用。第 7天收集細(xì)胞,即為 CTL。流式細(xì)胞術(shù)檢測 CTL分型、采用乳酸脫氫酸(LDH)4 h釋放法檢測 CTL的殺傷活性。以CTL作為效應(yīng)細(xì)胞,以自體肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞,效靶比為 25∶1,同時設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照孔。置酶標(biāo)儀測 490 nm的OD值,按公式計算CTL的殺傷率。以反映肝癌DC瘤苗及其活化CTL對肝癌細(xì)胞的作用。殺傷率(%)=(OD實-OD空)-(OD效-OD空)-(OD靶-OD空)/(OD靶最大釋放-OD靶校對)-(OD靶自然釋放-OD空)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以 x±s表示,兩組均數(shù)比較用 t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌DC瘤苗對自體T淋巴細(xì)胞增殖的影響 將負(fù)載肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗與術(shù)前及術(shù)后自體T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后,用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞增殖情況,肝癌DC瘤苗刺激術(shù)后自體 T淋巴細(xì)胞增殖能力及抑制腫瘤細(xì)胞作用顯著強于對術(shù)前自體 T淋巴細(xì)胞的作用,T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)術(shù)后(1.86±0.15)較術(shù)前(1.18±0.13)顯著增高、CD8+T細(xì)胞增殖指數(shù)術(shù)后(1.55±0.35)較術(shù)前(0.95±0.12)增加顯著,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。其中 T淋巴細(xì)胞亞群 CD8+T細(xì)胞增加顯著,肝癌DC瘤苗刺激術(shù)后自體 T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著強于刺激術(shù)前自體T淋巴細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 肝癌DC瘤苗及其活化CTL對肝癌細(xì)胞的作用 未加肝癌 DC瘤苗培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)良好,呈進行性生長,肝癌 DC瘤苗活化的術(shù)前自體CTL對自體肝癌細(xì)胞殺傷率,與肝癌 DC瘤苗活化的術(shù)后自體 CTL對自體肝癌細(xì)胞殺傷率比較顯示,肝癌 DC瘤苗活化的術(shù)后自體 CTL對自體肝癌細(xì)胞有較強殺傷作用,殺傷率由術(shù)前的(32.35±2.26)%增加到術(shù)后的(69.80±3.45)%,肝癌DC瘤苗活化的術(shù)后自體 CTL對自體肝癌細(xì)胞有較強殺傷作用。而二者對自體二倍體細(xì)胞無明顯殺傷作用(術(shù)后為 1.59±0.55)。

3 討 論

在腫瘤患者微環(huán)境下,腫瘤細(xì)胞通過分泌某些細(xì)胞因子對DC產(chǎn)生功能抑制,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有胚胎發(fā)育過程中,在腫瘤新生血管生成過程中起了關(guān)鍵性作用。實驗證明,許多腫瘤能分泌VEGF,VEGF在體內(nèi)體外均能導(dǎo)致DC的分化及功能缺陷〔4〕。 Rinaldi等〔5〕證實,腫瘤細(xì)胞表達相關(guān)抗原 GA 733-2,影響局部浸潤的 DC表面 MHC-Ⅱ類分子的表達,從而影響 DC對 T細(xì)胞抗原的遞呈和激活。Xie等〔6〕在對肝癌的研究中發(fā)現(xiàn),由于血清甲胎蛋白(AFP)的存在,腫瘤組織中浸潤的 DC表面不表達 CD86,CD80和 CD40,不能有效遞呈腫瘤抗原。Holmstrom等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)肝臟 DC的 TLR4 mRNA的表達降低,如果將腫瘤局部浸潤的 DC在體外用 GM-CSF及TNF或 CD40L刺激,DC不表達 CD80,CD86等共刺激分子,呈現(xiàn)未成熟 DC的表型特征,因此,DC在分化過程中存在缺陷。DC數(shù)量少,在腫瘤患者早期的外周血中DC的含量可比正常人少一半以上,而在晚期患者這種差異可達 4倍以上,單純這種數(shù)量的降低即可使腫瘤細(xì)胞免疫刺激變得相對沒那么有效〔8〕。

當(dāng)腫瘤細(xì)胞被切除后,患者體內(nèi)抑制DC成熟的各種因素作用減弱,機體內(nèi)DC分化及功能逐漸恢復(fù)正常,最直接的證據(jù)是當(dāng)腫瘤被切除后,抑制單核細(xì)胞分化發(fā)育的微環(huán)境被解除,單核細(xì)胞可以正常分化為未成熟DC,這時未成熟DC遇到腫瘤抗原后,其表面表達 MHC-Ⅱ類分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子增加,IL-12分泌增多,即成為成熟 DC〔9〕。成熟的DC常表達CC趨化因子受體 7(CCR7),它的表達增加有利于DC向引流淋巴結(jié)遷移,在那里DC能遇到初始T淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生〔10〕,只有成熟 DC能刺激初始型 CD4+T淋巴細(xì)胞,通過 TH1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 IL-12,IFN-γ,TNF等參與細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié),能夠激活CD8+T細(xì)胞又稱為CTL,直接發(fā)揮細(xì)胞毒作用,殺傷腫瘤細(xì)胞,通過分泌釋放效應(yīng)細(xì)胞因子如穿孔素,顆粒酶,淋巴毒素,TNF等引起靶細(xì)胞裂解或凋亡〔9〕。故術(shù)前肝癌患者體內(nèi),腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對樹突細(xì)胞的分化和發(fā)育影響較大,而術(shù)后肝癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對樹突細(xì)胞的影響較小。同時腫瘤可誘導(dǎo) T細(xì)胞成分和功能紊亂,有人研究分析荷瘤小鼠的胸腺中 T細(xì)胞亞群的比例失衡,細(xì)胞免疫功能異常,而且淋巴因子的功能亦可發(fā)生失調(diào),Th1可分泌 IL-2,IFN-γ等細(xì)胞因子,參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié),激活CD8+T細(xì)胞,增強其殺傷能力,或促進靶細(xì)胞 MHC-1類分子的表達,提高其對CTL的敏感性,抗腫瘤免疫應(yīng)以 Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主〔11〕,Th-2分泌 IL-4,IL-10等細(xì)胞因子,IL-4,IL-10是抑制 Th1應(yīng)答和介導(dǎo) Th2發(fā)育的主要細(xì)胞因子,yamamura和kharkevitch最早發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi) Th2型細(xì)胞因子較 Th1型細(xì)胞因子處于優(yōu)勢狀態(tài),也就是說腫瘤患者體內(nèi)術(shù)前較術(shù)后 Th2型細(xì)胞因子處于優(yōu)勢狀態(tài);經(jīng)手術(shù)后,肝癌患者體內(nèi)腫瘤抑制因子含量明顯減少,用肝癌抗原刺激 DC,其表面可更多表達 MHC-Ⅱ類分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子,IL-12分泌更多,刺激 CTL的殺傷作用更強,使負(fù)載肝癌抗原的DC瘤苗對自身T淋巴細(xì)胞的激活作用,術(shù)后較術(shù)前效果顯著。

本實驗結(jié)果顯示,肝癌DC瘤苗刺激術(shù)后自體 T淋巴細(xì)胞增殖能力及抑制腫瘤細(xì)胞作用顯著強于對術(shù)前自體 T淋巴細(xì)胞的作用,T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)較術(shù)前顯著增高,CD8+T細(xì)胞增殖指數(shù)較術(shù)前增加顯著,而且肝癌 DC瘤苗活化的術(shù)后自體CTL對自體肝癌細(xì)胞有較強殺傷作用,證明肝癌DC瘤苗活化的術(shù)后自體 CTL對自體肝癌細(xì)胞的殺傷力明顯強于對術(shù)前CTL殺傷自體肝癌細(xì)胞的能力。

目前,肝癌的治療方法有手術(shù)、放療和化療,HCC根治術(shù)后,常因不能清除遠處轉(zhuǎn)移的微小病灶而易造成復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,化療或放療又摧毀了機體的免疫功能,而DC是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細(xì)胞,在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用,目前由于肝癌特異性抗原尚不能明確鑒定〔11〕,制備 DC瘤苗回輸患者體內(nèi),可激發(fā)針對多個肝癌抗原的 T淋巴細(xì)胞免疫,減少了癌細(xì)胞逃逸的可能性,肝癌的生物治療在保護機體的免疫力的同時可以清除易造成轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的遠處微小病灶,副作用不顯著,成為繼手術(shù)、放療、化療后發(fā)展起來的腫瘤治療第 4大療法,本研究證實了肝癌的生物治療最好用于肝癌術(shù)后的患者效果更好。

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