飼料及其原料中尿素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 朱秀高 盧守英 朱靜

上海市上海農(nóng)場(chǎng) 曹慧

山東省臨朐縣臥龍獸醫(yī)站 劉偉

江西省吉安市畜牧獸醫(yī)局 劉克言

尿素是動(dòng)物蛋白質(zhì)補(bǔ)充料中應(yīng)用的主要非蛋白氮物質(zhì)。使用尿素一方面可以補(bǔ)充蛋白質(zhì)飼料的不足；另一方面還能減少魚(yú)粉等蛋白質(zhì)類(lèi)飼料的使用量，降低飼養(yǎng)成本。基于動(dòng)物利用尿素的機(jī)理，一般主要將尿素用于反芻動(dòng)物的養(yǎng)殖，且有較為嚴(yán)格的劑量添加要求，通常尿素在奶牛和羊精料補(bǔ)充料中的添加量不超過(guò)1.0%，肉牛精料補(bǔ)充料中添加量不超過(guò)1.5%（楊紅東等，2009）。

當(dāng)前報(bào)道中，關(guān)于尿素的檢測(cè)方法較多，但主要應(yīng)用在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。關(guān)于飼料及其原料中尿素的檢測(cè)方法主要集中在對(duì)二甲胺基苯甲醛法（DMAB）的應(yīng)用與改良。除此之外還有二乙酰肟法、甲酚紅法、脲酶波氏法和近紅外光譜法（NIS）等。本文僅就當(dāng)前關(guān)于飼料及其原料中尿素檢測(cè)方法的研究進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步完善和統(tǒng)一飼料中尿素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 DMAB法

目前多數(shù)文章及標(biāo)準(zhǔn)中均使用DMAB法檢測(cè)飼料或原料中的尿素，例如，SC/T 3510-1996、GB/T 19164-2003、AOAC 941-2004、ISO 6654-1991等。該方法的原理為DMAB與尿素反應(yīng)，生成黃色的對(duì)二甲胺基甲醛脲，此物質(zhì)的顏色深度與溶液中尿素含量成正比，因此可以通過(guò)測(cè)定在一定波長(zhǎng)下反應(yīng)溶液的吸光值來(lái)定量溶液中的尿素濃度，該反應(yīng)需要在酸性條件下進(jìn)行。

從相關(guān)報(bào)道來(lái)看，此方法在應(yīng)用中主要涉及兩方面：飼料樣品的前處理和與DMAB試劑的反應(yīng)。綜合各方文獻(xiàn)，樣品前處理所采用的方法基本相同，即使用木炭作為吸附劑吸收飼料溶液中的色素，防止溶液渾濁對(duì)后續(xù)反應(yīng)吸光值的測(cè)定產(chǎn)生干擾；利用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成亞鐵氰酸鋅來(lái)共沉淀樣品中的蛋白等潛在干擾物質(zhì)。大多研究者指出溶液中加入樣品及試劑后搖勻靜置20 min左右，待沉淀完全即可過(guò)濾，而武金鳳等（2008）報(bào)道，應(yīng)用此方法處理魚(yú)粉樣品時(shí)，為了使尿素完全提取，還需要將溶液振蕩30 min再靜置至沉淀沉積，這與ISO（1991）、崔淑文和馬車(chē)覆（1993）的方法基本相同。根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性來(lái)考慮，實(shí)際樣品測(cè)定中應(yīng)用先振蕩后靜置的操作過(guò)程能夠較好保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少可能由于提取引起的誤差。樣品經(jīng)過(guò)前處理后，即可從中取適量上清液加入試管中與一定量DMAB顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，在這一操作中需要考慮的問(wèn)題主要是待測(cè)樣品液的取樣量和反應(yīng)溫度，其中取樣量與樣品中的尿素濃度和反應(yīng)體系的測(cè)定范圍有關(guān)。翟毓秀（1993）報(bào)道，樣品經(jīng)過(guò)前處理，尿素含量在1%以下取15 mL、1%以上取5 mL加入25 mL反應(yīng)管中，然后加水至18 mL，再加入5 mL DMAB試劑用水定容，室溫放置10 min，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光值。崔淑文和馬車(chē)覆（1993）報(bào)道，魚(yú)粉樣品經(jīng)過(guò)前處理后直接取5 mL濾液于試管中，加5 mL DMAB溶液，充分振搖后置于25℃水浴中10 min，取出即可于420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光值。武金鳳等（2008）在實(shí)驗(yàn)中吸取含氮量為0.2～10 mg的濾液5～10 mL加入25 mL反應(yīng)管中，再加5 mL DMAB溶液，用水定容至刻度后混勻放置20 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)溶液在25℃水浴和常溫條件下放置20 min，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

楊珩和吳玉生（1997）還提出了一種簡(jiǎn)單、快速的試紙條定性、半定量測(cè)定法，該方法應(yīng)用預(yù)先經(jīng)10%硫酸氫鉀和2%DMAB溶液浸泡制備的試紙條，將其插入樣品溶液中（此樣品溶液無(wú)需加入木炭、乙酸鋅與亞鐵氰化鉀處理），根據(jù)2 min內(nèi)試紙條顏色的變化即可定性溶液中尿素的有無(wú)（試紙條呈黃色即為尿素陽(yáng)性），其檢出限為0.01%；而將測(cè)定后的試紙條與已知尿素濃度下的試紙條顏色進(jìn)行對(duì)比即可實(shí)現(xiàn)樣品溶液中尿素的半定量。

DMAB法雖然較為常用，但由于其試劑本身在420～436 nm具有較高的吸收值，所以操作過(guò)程中要嚴(yán)格控制顯色劑的加入量，一般推薦添加試劑5 mL。陳靈華（1998）指出，試劑空白吸收程度隨測(cè)定波長(zhǎng)的增大而下降，同樣波長(zhǎng)下樣品吸光值的變化則不大，所以推薦可以使用440 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，這樣就可以盡量減少由于試劑添加量變化而引起的誤差，從武金鳳等（2008）報(bào)告中的反應(yīng)溶液掃描圖譜也可以看到波長(zhǎng)為420～440 nm時(shí)，吸光值無(wú)顯著性變化，因此，本方法測(cè)定飼料樣品的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中可以探討在這兩個(gè)波長(zhǎng)下試劑吸收有無(wú)顯著性差異，以確定反應(yīng)溶液的最適測(cè)定波長(zhǎng)。

2 甲酚紅法

甲酚紅是滴定分析中常用的一種指示劑，濃度為0.1%溶液的變色范圍為pH 7.2～8.8（黃色變?yōu)榧t色），此顏色變化通過(guò)肉眼即能明顯分辨。應(yīng)用甲酚紅法測(cè)定飼料中尿素的主要原理是尿素在脲酶水解作用下產(chǎn)氨而使溶液pH升高，引起甲酚紅溶液顏色發(fā)生相應(yīng)變化，從而根據(jù)顏色是否發(fā)生改變及深淺來(lái)定性半定量溶液中尿素的有無(wú)和含量。

當(dāng)前研究一致認(rèn)為該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢(shì)，因而可以在樣品快速測(cè)定中予以推廣使用。孫新來(lái)和趙慧（1990）報(bào)道，通過(guò)30多次實(shí)驗(yàn)分析，表明將新鮮黃豆中提取的脲酶應(yīng)用于其改進(jìn)的甲酚紅顯色法中，反應(yīng)在30 s開(kāi)始顯色、尿素檢出率達(dá)100%、靈敏度達(dá)0.01%，與購(gòu)買(mǎi)商品化脲酶相比具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。在《飼料顯微鏡檢與質(zhì)量控制手冊(cè)》一書(shū)中，作者推薦測(cè)定樣品時(shí)同時(shí)測(cè)定一系列尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～5%），在10～12 min觀(guān)察比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色，可以半定量樣品中的尿素濃度。孟丹勝（1994）詳細(xì)介紹了應(yīng)用甲酚紅檢測(cè)飼料中尿素含量的過(guò)程及可能遇到的問(wèn)題和解決方法，其中主要包括試劑純度和有效性的檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果假陽(yáng)性和假陰性的排除。

從應(yīng)用該方法檢測(cè)血清尿素的報(bào)道來(lái)看，臨床研究中已經(jīng)開(kāi)始將甲酚紅法用于血清尿素的定量測(cè)定。鄧福貴和李斌（1997）報(bào)道，以甲酚紅為指示劑酶法測(cè)定血清尿素，其反應(yīng)溶液的吸收峰為572 nm；反應(yīng)在5 min即可達(dá)到平衡，且吸光值在2 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定；尿素濃度在75 mmol/L內(nèi)線(xiàn)性良好；血清中的其他物質(zhì)及pH的適度變化對(duì)反應(yīng)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響，與酶偶聯(lián)速率法同時(shí)測(cè)定臨床樣品后所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的相關(guān)性，作者認(rèn)為，應(yīng)用甲酚紅法測(cè)定血清尿素的靈敏度要明顯高于鄰甲酚酞絡(luò)合劑和甲基麝香草酚藍(lán)。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果分析，在目前該方法已經(jīng)可以定性半定量測(cè)定飼料中尿素的情況下，下一步可以研究將該方法與DMAB法中的樣品前處理過(guò)程相結(jié)合，以定量樣品中的尿素。

3 二乙酰肟法

二乙酰反應(yīng)又叫丁二酮反應(yīng)，由Fearon于1939年首先報(bào)道，因此又稱(chēng)為Fearon反應(yīng)。該反應(yīng)初始為尿素與二乙酰反應(yīng)，但由于二乙酰溶液不穩(wěn)定，所以目前多使用二乙酰肟作為反應(yīng)基礎(chǔ)試劑。其基本反應(yīng)原理為，二乙酰肟首先在酸性條件下解離為二乙酰和羥胺，然后二乙酰與尿素在加熱的酸性條件下形成紅色二嗪衍生物。此反應(yīng)產(chǎn)物顏色深淺程度與樣品溶液中尿素含量呈正比，因此可以通過(guò)測(cè)定特定波長(zhǎng)下反應(yīng)溶液吸光值來(lái)定量溶液中的尿素。目前研究已經(jīng)證實(shí)向試劑中添加一定濃度硫胺脲、安替比林和金屬離子等可以提高反應(yīng)溶液和試劑穩(wěn)定性、增加反應(yīng)靈敏度等。

目前應(yīng)用該方法檢測(cè)飼料中尿素的報(bào)道較少，而且該方法在發(fā)展中出現(xiàn)了較多的改良法，各改良法之間在操作上并不完全統(tǒng)一，尤其是大部分方法的試劑組成不一致，造成了反應(yīng)產(chǎn)物的多樣性，主要表現(xiàn)在各方法的最適測(cè)定波長(zhǎng)均不相同，而且目前也少見(jiàn)關(guān)于不同試劑組成方法間測(cè)定結(jié)果相關(guān)性的研究，所以各報(bào)道間均無(wú)較好的可比性。許瑾和才紹河（2001）報(bào)道，將適當(dāng)處理后的樣品與二乙酰肟和硫胺脲共煮后，可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)溶液在500 nm處的吸光值來(lái)定量樣品中的尿素。戴永利（2006）認(rèn)為，處理過(guò)的樣品溶液與二乙酰肟、硫脲和硫酸鎘溶液混合后，于沸水浴12 min置水中冷卻5 min，即可在540 nm處測(cè)定反應(yīng)溶液的光密度（OD）值。羅若榮（2001）應(yīng)用該法測(cè)定淀粉中尿素含量后指出，樣品與二乙酰肟和安替比林的反應(yīng)溶液最大吸收峰在460 nm，因此要在460 nm處測(cè)定溶液的吸光值。

該方法在進(jìn)一步研究中，除了要繼續(xù)探討其對(duì)飼料中尿素的檢測(cè)能力外，還應(yīng)該對(duì)每種改良方法進(jìn)行深入摸索，盡可能統(tǒng)一各方法的試劑組成和檢測(cè)手段，以發(fā)揮該方法特異性強(qiáng)等的優(yōu)勢(shì)。

4 NIS法

NIS法是90年代以來(lái)在國(guó)內(nèi)發(fā)展較快的一種飼料無(wú)損檢測(cè)分析技術(shù)，其最顯著的優(yōu)勢(shì)是分析操作簡(jiǎn)單、快速。根據(jù)美國(guó)材料與實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）的定義NIS是指波長(zhǎng)為780～2526 nm的非可見(jiàn)光，目前所說(shuō)的NIS技術(shù)主要是指相對(duì)近紅外光譜（NIRS）分析技術(shù)。當(dāng)前飼料領(lǐng)域內(nèi)已有許多關(guān)于應(yīng)用該方法檢測(cè)飼料營(yíng)養(yǎng)成分或進(jìn)行飼料品質(zhì)控制的研究報(bào)道，但相關(guān)尿素檢測(cè)的報(bào)道并不多見(jiàn)。 González-Martín 和 Hernández-Hierro（2008）應(yīng)用NIRS技術(shù)結(jié)合光纖維遠(yuǎn)反射探針（Foss NIR System 5000），首先建立尿素、縮二脲和禽類(lèi)排泄物的判別偏最小二乘法（DPLS）模型，然后用此模型檢測(cè)添加有這些物質(zhì)的苜蓿草粉，其精確度分別為96.9%、100%和100%，而采用改進(jìn)偏最小二乘法（MPLS）計(jì)算所得到的各物質(zhì)濃度與添加濃度間的校正相關(guān)系數(shù)（RSQ）和標(biāo)準(zhǔn)分析誤差 （SEP）分別為尿素 0.990和0.28%、縮二脲0.991和0.29%、禽類(lèi)排泄物0.925和2.08%，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以直接快速同時(shí)定性和定量大批量苜蓿樣品中的尿素、縮二脲及禽類(lèi)排泄物。

NIS作為一種新興技術(shù)，具有良好的發(fā)展前景，特別是將其應(yīng)用在進(jìn)出口和商檢部門(mén)，能極大地提高工作效率，該方法目前的主要缺陷是儀器價(jià)格居高不下及樣品檢測(cè)模型的缺少，因此后續(xù)工作中尚需進(jìn)一步加大對(duì)該方法的研究力度，努力降低成本，建立適用于不同地區(qū)和樣品的檢測(cè)模型，從而充分發(fā)揮該方法的優(yōu)勢(shì)。

5 酶解波氏法

脲酶又稱(chēng)尿素酰胺水解酶，相對(duì)分子質(zhì)量為120000～130000，廣泛存在于豆類(lèi)植物籽實(shí)、土壤及動(dòng)物消化道內(nèi)，能高度特異性水解尿素形成氨和二氧化碳。酶解波氏法原理為首先利用脲酶特異性分解樣品溶液中的尿素形成氨和二氧化碳，在堿性條件下，氨與次氯酸鹽反應(yīng)形成氯化胺，氯化胺再與反應(yīng)溶液中的苯酚和次氯酸鹽反應(yīng)形成奎諾氯胺，最后奎諾氯胺與溶液中的其他苯酚分子反應(yīng)形成藍(lán)色的吲哚酚，此吲哚酚在酸性條件下能夠發(fā)生解離，反應(yīng)產(chǎn)物在630 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收峰，且反應(yīng)溶液顏色深度的變化與尿素含量成正比，因此可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)溶液吸光值來(lái)定量溶液中的尿素。目前研究已經(jīng)證實(shí)亞硝基鐵氰化鈉對(duì)反應(yīng)具有催化作用。

雖然目前應(yīng)用該方法測(cè)定飼料中尿素的研究很少，但臨床醫(yī)學(xué)研究中已經(jīng)證實(shí)該方法的精密度和準(zhǔn)確性要明顯好于其他方法。O’Keeffe和Sherington（1983）研究了酶解波氏法、DMAB 法和酶解Conway微擴(kuò)散法測(cè)定配合飼料中尿素的能力，結(jié)果顯示酶解波氏法的準(zhǔn)確性和精密度與DMAB法（EU標(biāo)準(zhǔn)）具有可比性，而且要好于酶解Conway微擴(kuò)散法，結(jié)果表明，臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的酶解波氏試劑盒能夠用于測(cè)定配合飼料和新鮮青貯料中的尿素，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉和可用于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)。

另外，應(yīng)用酶解波氏法檢測(cè)飼料及原料中尿素還具有樣品處理簡(jiǎn)單、干擾物質(zhì)少等明顯優(yōu)勢(shì)。所以對(duì)該方法還需深入研究，以建立一種新的有效檢測(cè)飼料中尿素的方法。

除了上述幾種常用方法外，還有其他一些方法也有報(bào)道，董春明和周天舒（2006）在高效液相色譜（HPLC）中采用甲醇-乙酸體系流動(dòng)相對(duì)混合飼料樣品中的尿素進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的線(xiàn)性，其加標(biāo)回收率為95%～104%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%。

6 小結(jié)

綜合分析上面幾種方法，根據(jù)測(cè)定結(jié)果分析，可以分為定性和定量?jī)深?lèi)，其中定性分析有甲酚紅法和NIS法兩種，定量分析有DMAB法、二乙酰肟法和酶解波氏法，不過(guò)從具體操作來(lái)說(shuō)，這兩類(lèi)并不能?chē)?yán)格區(qū)分。例如DMAB法也可以用于定性，而甲酚紅法和NIS法也能夠進(jìn)行定量。從方法的測(cè)定原理考慮，可以分為尿素直接測(cè)定法和尿素間接測(cè)定法，前者有NIS法、DMAB法和二乙酰肟法，后者包括甲酚紅法和酶解波氏法兩種。在實(shí)際應(yīng)用中，我們可以考慮根據(jù)上述幾種方法的各自特點(diǎn)及分析要求，對(duì)不同方法結(jié)合使用，建立一套完整的從現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)室精確分析的飼料中尿素含量檢測(cè)體系，以滿(mǎn)足既能夠?qū)Υ笈繕悠房焖俸Y選，又可以達(dá)到精確定量的目的。

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