寄生蟲MicroRNA的研究進展

徐民俊，賀現(xiàn)輝，朱興全*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅蘭州730046)

寄生蟲嚴(yán)重危害人和動物的生命及健康，并造成巨大經(jīng)濟損失。目前，對人和動物寄生蟲病的防治仍然主要依靠使用抗寄生蟲藥物。在養(yǎng)殖業(yè)中，由于抗寄生蟲藥物的長期過度使用造成的寄生蟲抗藥性問題及動物產(chǎn)品和環(huán)境中的藥物殘留問題，已引起人們的關(guān)注，并一直在尋找更為有效的防治寄生蟲病的新途徑。1993年在秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中 MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7的發(fā)現(xiàn)為寄生蟲的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供了新的契機[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，在動物中來源于長度約70 bp～90 bp的前體。前體經(jīng)過雙鏈RNA特異性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最終形成18 nt～22 nt長度的成熟miRNA[2-4]，然后通過與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合導(dǎo)致靶基因翻譯阻遏或者降解，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控[5-6]。

復(fù)雜的生活環(huán)境、不同的生活形態(tài)和周期以及性別分化均表明，寄生蟲具有非常復(fù)雜的基因表達調(diào)控系統(tǒng)。開展寄生蟲miRNA研究不僅有利于了解對寄生蟲生活史，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶標(biāo)或設(shè)計新的核酸疫苗，為有效防治寄生蟲病提供新的途徑。本文對寄生蟲miRNA的研究進展進行綜述，以期為寄生蟲的深入研究提供參考。

1 寄生蠕蟲

1.1 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) Xue等在日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)了5種新的miRNA，其中4種具有保守性的 miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125 和 sja-bantam)，1種(sja-miR-new1)為血吸蟲特有。對這5種新的miRNA在日本血吸蟲6個發(fā)育期中表達情況的分析表明，這些miRNA表現(xiàn)出高度的期特異性[7]。

對秀麗新桿線蟲和果蠅的研究表明，let-7具有很強的時序調(diào)控特性，主要在幼蟲發(fā)育后期表達，在幼蟲向成蟲的發(fā)育階段非常關(guān)鍵，而其調(diào)控機制會受到其它因素(如蛻皮激素或蛻皮激素合成過程的中間產(chǎn)物)的影響[8]。在日本血吸蟲研究中發(fā)現(xiàn)的let-7均表現(xiàn)為高度的期特異性；其表達量在毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的12倍，在尾蚴期達到高峰。因此，推測let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調(diào)控相關(guān)[7]，但尚未得到實驗證實。

另外兩種miRNA sja-miR-71和sja-bantam的表達情況與let-7類似，都是在毛蚴期開始表達，在尾蚴期達到高峰。而尾蚴是血吸蟲的感染期，當(dāng)尾蚴進入宿主動物細(xì)胞后，sja-miR-71的表達立刻降到最低水平然后進入童蟲期，并在此后的生命活動過程中始終保持在較低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表達量高于童蟲期近1 000倍，sja-bantam則高達近500倍。這種表達量的變化只與生活周期變化相關(guān)，與性別無關(guān)[7]。由于寄生蟲在感染宿主之前必然有基因表達模式的改變和相關(guān)的蛋白表達，miR-71和bantam的變化規(guī)律似乎表明這兩種miRNA與尾蚴入侵宿主細(xì)胞相關(guān)的基因調(diào)節(jié)活動密切相關(guān)。

值得注意的是，miR-71和bantam及其前體都是高度保守的。根據(jù)Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(Version11.0，http://www.mirbase.org/)登錄的數(shù)據(jù)，miR-71不唯寄生蟲獨有，也存在于其它物種中(包括人類、小鼠、蜜蜂、蠶、渦蟲等)。不過，目前尚未見到miR-71在植物和病毒中的報道，是否miR-71只存在動物中還有待研究。此外，miR-71在不同物種中通常都具有很大的家族，包括miR-71a、miR-71a-1、miR-71b和 miR-71c等。Bantam存在于果蠅、蠶和渦蟲等節(jié)肢動物和無脊椎動物中，在哺乳類動物及植物中未見報導(dǎo)。除此之外，在果蠅中的研究也已表明，bantam通過對hid基因的調(diào)控影響細(xì)胞的增殖和凋亡，bantam的沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力降低或者凋亡速度增加，減少內(nèi)源性bantam編碼基因?qū)е耯id基因表達量上升，而增加內(nèi)源性bantam編碼基因則反之[11]。這些現(xiàn)象表明，miR-71和bantam在寄生蟲侵染宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中似乎并不是關(guān)鍵因素，其表達量的提高很可能與寄生蟲細(xì)胞的基礎(chǔ)生理代謝有關(guān)，即當(dāng)寄生蟲感染宿主時，相關(guān)基因大量表達，所需要的基礎(chǔ)代謝隨之提高，相應(yīng)地激發(fā)了miR-71的表達，以對基礎(chǔ)代謝進行精確調(diào)控。這表明miR-71和bantam與生長發(fā)育密切相關(guān)，但是否作為寄生蟲侵染宿主的調(diào)控因子仍然有待進一步研究。

此外，基礎(chǔ)代謝率的提高是否能引起寄生蟲的miR-71或bantam表達量的相應(yīng)提高，或者通過RNA沉默技術(shù)下調(diào)miR-71或bantam的表達從而導(dǎo)致其基礎(chǔ)代謝的紊亂，抑制幼蟲發(fā)育甚至阻礙尾蚴對宿主侵染，有關(guān)這方面的研究目前尚未見報道。如果假設(shè)成立，通過RNA沉默技術(shù)阻礙相關(guān)miRNA，尤其let-7、miR-71或bantam的表達將為控制寄生蟲發(fā)育和感染提供一條新途徑。

1.2 曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni) Gomes等通過生物信息學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)了曼氏血吸蟲SmDicer1和SmAgo2/3/4蛋白編碼基因并在尾蚴、成蟲、卵和體外培養(yǎng)的曼氏血吸蟲中對其表達進行了驗證，結(jié)果表明SmDicer1和SmAgo2/3/4在不同發(fā)育階段表達水平不同，推測miRNA的調(diào)控可能是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，并借此對曼氏血吸蟲生活史的不同發(fā)育階段進行調(diào)控[9]。曼氏血吸蟲的Dicer基因(SmDicer)長度超過了54 kb，包含30個外顯子，可以編碼一個2 641氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，是目前已知最大的Dicer蛋白[10]。Dicer和AGO蛋白的發(fā)現(xiàn)進一步表明在血吸蟲中存在miRNA調(diào)控體系。

此外，在血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的miRNA還包括：Copeland等通過生物信息學(xué)手段從曼氏血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的1種miRNA(miR-124)，該miRNA也存在于日本血吸蟲中。同時發(fā)現(xiàn)的另外一種miRNA(miR-287)，似乎只存在于曼氏血吸蟲中。在與血吸蟲遺傳距離較遠的渦蟲(Schmidtea mediterranea)中發(fā)現(xiàn)的71種miRNA中，miR-124及miR-749在血吸蟲的兩個種中均保守存在[12]。

2 寄生原蟲

2.1 藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia) AGO蛋白在藍氏賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性地與m(7)G-帽子結(jié)合，從而協(xié)助miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，藍氏賈第鞭毛蟲的至少4種miRNA來源于細(xì)胞內(nèi)的小核仁RNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)。在Dicer的作用下，snoRNA GlsR17被加工為26 nt大小的miRNA(miR2)。熒光素酶(Luciferase)基因在其 3'端包含6個與miR2作用位點一致的序列，將該酶的mRNA與人工合成的miR2共同溫育，則導(dǎo)致熒光素酶的表達量下降40%，而mRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很可能是通過翻譯阻遏而不是mRNA降解完成的。通過核糖體反義RNA抑制藍氏賈第鞭毛蟲AGO蛋白的表達，熒光素酶的合成則不會受到影響。另一方面，Dicer基因的沉默則會導(dǎo)致細(xì)胞中snoRNA不能被分解，相應(yīng)miRNA在細(xì)胞中的含量急劇降低。同時變異表面糖蛋白(Variant surface glycoprotein，VSG)表達不受限制，由單一表達變成多表達，表明調(diào)節(jié)藍氏賈第蟲的抗原變異是miRNA的沉默調(diào)節(jié)功能之一[13-14]。

藍氏賈第鞭毛蟲是miRNA研究中第一個經(jīng)過克隆和實驗驗證的原蟲。起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的發(fā)現(xiàn)擴展了寄生原蟲的調(diào)節(jié)性小RNA的來源。該研究首次提出miRNA來源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身編碼，意味著在miRNA介導(dǎo)的基因沉默過程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑[15]。這種現(xiàn)象也意味著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的RNA分子(如 rRNA，tRNA和 snRNA)并且與 AGO相關(guān)的小 RNA很可能也具有調(diào)節(jié)基因表達的功能。

2.2 布氏錐蟲(Typanosoma brucei) Mallick等預(yù)測了1 889個成熟的miRNAs，以及這些miRNA潛在的VSG作用位點[16]。在布氏錐蟲的基因組中也發(fā)現(xiàn)了類似Dicer編碼基因功能的序列，Dicer編碼基因和預(yù)測的miRNA意味著在錐蟲中存在著miRNA調(diào)節(jié)的功能性網(wǎng)絡(luò)。此外，在布氏錐蟲中發(fā)現(xiàn)了一些siRNA(Small interfering RNA)，具有類似miRNA功能，可以導(dǎo)致相關(guān)mRNA的降解。與miRNA不同，這些siRNA長度約25 nt，來自于長的dsRNA，并且具有轉(zhuǎn)座子(transposon)特性[17-18]。

2.3 陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis) Lin等從陰道毛滴蟲中發(fā)現(xiàn)了9種miRNA。這9種miRNA在其它22種原蟲基因組中至少存在一個同源miRNA拷貝，其中miR-006高度保守。但是在溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)和錐蟲中未發(fā)現(xiàn)任何同源性。除此之外，在陰道毛滴蟲中至少存在兩種AGO蛋白(tvAGO1和tvAGO2)，AGO蛋白的發(fā)現(xiàn)證明了miRNA在陰道毛滴蟲中的調(diào)控是確實存在的[19]。由此可見，寄生蟲基因表達調(diào)控機制以及miRNA的種類在某些物種間具有較大的差異。

2.4 瘧原蟲(Plasmodium) 雖然在瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄后抑制現(xiàn)象，并且找到了mRNA保守的3'端非翻譯區(qū)，但是卻沒有發(fā)現(xiàn)與miRNA調(diào)節(jié)作用相關(guān)的Dicer和AGO相關(guān)蛋白基因[20-22]。此外，不同研究者從被瘧原蟲感染的紅細(xì)胞中均只發(fā)現(xiàn)了大量的人類miRNA(以miR-451為主)，而在純化的瘧原蟲中沒有發(fā)現(xiàn)任何miRNA或者siRNA，而且miR-45似乎只與紅細(xì)胞成熟分化以及形態(tài)維持相關(guān)，與瘧原蟲感染與否無關(guān)[23-24]。這似乎意味著瘧原蟲具有不同的調(diào)控機制。

2.5 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica) De等從溶組織內(nèi)阿米巴中預(yù)測了17個miRNA，并且從該寄生蟲的基因組中發(fā)現(xiàn)了與miRNA調(diào)控相關(guān)的AGO及Dicer蛋白的相關(guān)編碼基因[25]。這些miRNA的功能可能包括參與GTP-結(jié)合蛋白(miR-2a)、蛋白激酶(miR-3a)和Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(miR-15b)的作用等。

3 節(jié)肢動物

3.1 按蚊(Anophelesspp.) Mead等在17日齡的雌性斯氏按蚊(A.stephensi)中分離到27種miRNA，7種與岡比亞按蚊(A.gambiae)的miRNA具有同源性，4種為新發(fā)現(xiàn)的miRNA(miR-x1-miR-x4)，這些miRNA對斯氏按蚊從晚期胚胎到成蟲的發(fā)育非常關(guān)鍵[26]。在4種新發(fā)現(xiàn)的miRNA中，miR-x2在斯氏按蚊和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中保守，并且主要分布在卵巢中，在按蚊飽食血液72 h之后，表達量急劇下降，因此推測其功能在不同種類的蚊科中均與生殖調(diào)控相關(guān)。miR-14在按蚊胚胎晚期到成蟲的發(fā)育過程中表達量非常高(占測序miRNA數(shù)目的25%)，并且此后在按蚊成蟲一生之中持續(xù)表達，這種表達與性別、年齡和進食過血液與否無關(guān)。由于其在果蠅中與細(xì)胞壽命和凋亡密切相關(guān)，因此推測其對按蚊生活史各個階段的生長發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要。

Winter等從感染瘧原蟲后的岡比亞按蚊中分離到18種miRNA[27]。其中12種在蟲體的各個部位分布均勻，并且與性別無關(guān)，而其它6種則與消化系統(tǒng)緊密關(guān)聯(lián)。瘧原蟲存在與否會直接影響到其中4種miRNA的表達模式，當(dāng)瘧原蟲感染時，在瘧蚊中腸中Aga-miR-34，A-ga-miR-1174和Aga-miR-1175表達量均下降超過 50%，Aga-miR-989則升高了近4倍。同時，在其它組織和器官中Aga-miR-989表達量則下降了60%。通過dsRNA對Dicer1和AGO1基因進行的沉默研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Dicer1和AGO1不存在時瘧原蟲對瘧蚊的感染敏感性增加。由此推斷，miRNA在瘧蚊的抗瘧原蟲感染方面發(fā)揮著重要作用。

3.2 肩突硬蜱(Ixodes scapularis) Wheeler等在研究物種進化的過程中，獲得肩突硬蜱的32種miRNA，并被Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫收錄[28]。這 32種 miRNA與 miRBase數(shù)據(jù)庫收錄的其它寄生蟲，包括日本血吸蟲(5種)，曼氏血吸蟲(5種)以及按蚊(66種)miRNA序列相比，只有bantam，let-7，miR-71，和miR-125等4種miRNA是保守的。同為節(jié)肢動物，肩突硬蜱與瘧蚊之間有24種保守miRNA。

4 小結(jié)與展望

目前發(fā)現(xiàn)的寄生蟲miRNA主要為表達豐度高和分布廣的種類，例如let-7，miR-71和bantam等；而表達豐度低、呈期特異性的miRNA發(fā)現(xiàn)的很少；已發(fā)現(xiàn)的miRNA主要與生長發(fā)育相關(guān)，與寄生蟲侵染宿主相關(guān)的關(guān)鍵miRNA尚未見報導(dǎo)。此外，盡管目前在寄生蟲中預(yù)測的miRNA已經(jīng)接近2 000種，但是多數(shù)miRNA的具體功能仍然有待實驗驗證。

據(jù)估計，細(xì)胞中miRNA總數(shù)占基因組所有編碼基因的1%～3%，因此其在生長發(fā)育和形態(tài)調(diào)控中必定有著巨大作用等待深入研究。絕大多數(shù)miRNA的表達具有發(fā)育階段的特異性、時序性或組織特異性，這也從側(cè)面說明了其在基因調(diào)控方面的作用[2,29-30]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的寄生蟲miRNA表明，miRNA廣泛地參與了寄生蟲發(fā)育過程的生理代謝過程，但是其具體的作用機理仍然有待深入研究。

[1]Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.TheC.elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[2]Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[3]Hutvágner G,McLachlan J,Pasquinelli A E,et al.A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of thelet-7 small temporal RNA[J].Science,2001,293(5531):834-838.

[4]Ruby J G,Jan C H,Bartel D P.Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing[J].Nature,2007,448(7149):83-86.

[5]Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[6]Thermann R,Hentze M W.DrosophilamiR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation [J].Nature,2007,447(7146):875-878.

[7]Xue X,Sun J,Zhang Q,et al.Identification and characterization of novel microRNAs fromSchistosoma japonicum[J].PLoS One,2008,3(12):e4034.

[8]Sempere L F,Dubrovsky E B,Dubrovskaya V A,et al.The expression of thelet-7 small regulatory RNA is controlled by ecdysone during metamorphosis inDrosophila melanogaster[J].Dev Biol,2002,244(1):170-179.

[9]Gomes M S,Cabral F J,Jannotti-Passos L K,et al.Preliminary analysis of miRNA pathway inSchistosoma mansoni[J].Parasitol Int,2009,58(1):61-68.

[10]Krautz-Peterson G,Skelly P J.Schistosoma mansoni:the dicer gene and its expression[J].Exp Parasitol,2008,118(1):122-128.

[11]Brennecke J,Hipfner D R,Stark A,et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid inDrosophila[J].Cell,2003,113(1):25-36.

[12]Copeland C C,Marz M,Rose D,et al.Homology-based annotation of non-coding RNAs in the genomes ofSchistosoma mansoniandSchistosoma japonicum[J].BMC Genomics,2009,10:464.

[13]Saraiya A A,Wang C C.SnoRNA,a novel precursor of microRNA inGiardia lamblia[J].PLoS Pathog,2008,4(11):e1000224.

[14]Prucca C G,Slavin I,Quiroga R,et al.Antigenic variation inGiardia lambliais regulated by RNA interference[J].Nature,2008,456(7223):750-754.

[15]Kolev N G,Ullu E.SnoRNAs inGiardia lamblia:a novel role in RNA silencing?[J].Trends Parasitol,2009,25(8):348-350.

[16]Mallick B,Ghosh Z,Chakrabarti J.MicroRNA switches inTrypanosoma brucei[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,372(3):459-463.

[17]Djikeng A,Shi H,Tschudi C,et al.RNA interference inTrypanosoma brucei:cloning of small interfering RNAs provides evidence for retroposon-derived 24-26-nucleotide RNAs[J].RNˇA,2001,7(11):1522-1530.

[18]Ngo H,Tschudi C,Gull K,et al.Double-stranded RNA induces mRNA degradation inTrypanosoma brucei[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(25):14687-14692.

[19]Lin W C,Li S C,Lin W C,et al.Identification of microRNA in the protistTrichomonas vaginalis[J].Genomics,2009,93(5):487-493.

[20]Aravind L,Iyer L M,Wellems T E,et al.Plasmodiumbiology:genomic gleanings[J].Cell,2003,115(7):771-785.

[21]Ullu E,Tschudi C,Chakraborty T.RNA interference in protozoan parasites[J].Cell Microbiol,2004,6(6):509-519.

[22]Hall N,Karras M,Raine J D,et al.A comprehensive survey of thePlasmodiumlife cycle by genomic,transcriptomic,and proteomic analyses[J].Science,2005,307(5706):82-86.

[23]Rathjen T,Nicol C,McConkey G,et al.Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host[J].FEBS Lett,2006,580(22):5185-5188.

[24]Xue X,Zhang Q,Huang Y,et al.No miRNA were found inPlasmodiumand the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection[J].Malar J,2008,7:47-50.

[25]De S,Pal D,Ghosh S K.Entamoeba histolytica:computational identification of putative microRNA candidates[J].Exp Parasitol,2006,113(4):239-243.

[26]Mead E A,Tu Z.Cloning,characterization,and expression of microRNAsfrom the Asian malariamosquito,Anopheles stephensi[J].BMC Genomics,2008,9:244.

[27]Winter F,Edaye S,Hüttenhofer A,et al.Anopheles gambiaemiRNAs as actors of defence reaction againstPlasmodiuminvasion[J].Nucleic Acids Res,2007,35(20):6953-6962.

[28]Wheeler B M,Heimberg A M,Moy V N,et al.The deep evolution of metazoan microRNAs[J].Evol Dev,2009,11(1):50-68.

[29]Lim L P,Glasner M E,Yekta S,et al.Vertebrate microRNA genes[J].Science,2003,299(5612):1540.

[30]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms:growth,death,fat,stress and timing[J].Cell,2003,113(6):673-676.