孔雀新城疫病毒F基因的克隆及其變異分析

鞠厚斌，曹火仁，張維誼，劉 健，周錦萍

(1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201103；2.上海市松江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201611)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起禽類的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病，多見于雞和珍珠雞，也能感染其他家禽和野禽[1]。該病廣泛存在于世界各地，特別是強(qiáng)毒株可導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)臟器官的損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，死亡率高[2]，對養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了極大威脅。目前，NDV疫苗的使用是預(yù)防該病的主要手段[3]。NDV F基因編碼的融合(F)蛋白是病毒感染細(xì)胞的重要成分，通過它完成病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，導(dǎo)致病毒穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[4]。

本實(shí)驗(yàn)針對上海某珍禽場送檢的2只病死孔雀進(jìn)行剖檢，結(jié)合其流行特點(diǎn)及發(fā)病情況疑以ND[5-7]。進(jìn)行了NDV熒光RT-PCR檢測和F基因的序列分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病情況 該養(yǎng)殖場從2008年11月不斷出現(xiàn)發(fā)病孔雀，表現(xiàn)為精神沉郁，食欲減退，少數(shù)有神經(jīng)癥狀，發(fā)病5 d～6 d后，有2只死亡。

1.2 剖檢變化 送檢的2例孔雀，剖檢肝均有白色壞死灶或有萎縮，腸道萎縮、糜爛，其中一只胰腺和脾臟均有壞死灶。

1.3 細(xì)菌學(xué)診斷 分別無菌采集孔雀腦、心、肝、脾、腎、肺等組織樣品，接種于Glunbia羊血瓊脂上，置37℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)菌分離檢測。

1.4 NDV熒光RT-PCR檢測 采集病鴿的腦、氣管、氣管粘液、肝臟、腎、肺等組織樣品，研磨，加入適量PBS制成懸液，7 500 r/min離心5 min，取上清，使用TaqMan探針NDV熒光RT-PCR檢測試劑盒(深圳匹基生物有限公司，批號(hào)：20081001)進(jìn)行檢測。

1.5 F基因的克隆

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank登錄的Guangxi10/2003株(DQ485261)F基因序列，設(shè)計(jì)了兩條特異性引物P1、P2，擴(kuò)增長度為1 884 bp，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，分別為：

P1：5'-TGATCCATCTCGACTGCTTAT-3'；

P2：5'-ACCCGTGTATTGCTCTTTG-3'。

1.5.2 病毒總RNA的提取 使用AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取病毒 RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.5.3 F基因的擴(kuò)增 使用TaKaRa公司的一步法試劑盒對提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃2 min；再按以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94℃30 s，45℃30 s，72℃2 min；最后72℃延伸10 min。結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.4 F基因的克隆及序列分析 鑒定陽性的樣本PCR產(chǎn)物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果用DNAStar軟件分析，同時(shí)與GenBank登錄的其他NDV F基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌學(xué)診斷 Glunbia羊血瓊脂培養(yǎng)皿中未見有細(xì)菌生長。

2.2 NDV熒光RT-PCR檢測 2只孔雀病毒核酸檢測結(jié)果均為NDV陽性(圖1)。

2.3 目的基因擴(kuò)增 應(yīng)用所設(shè)計(jì)的特異引物，2份樣品均擴(kuò)增出預(yù)期的基因片段，大小為1884bp(圖2)。

2.4 F基因的同源性分析與遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建 為了進(jìn)一步了解該毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，應(yīng)用DNAStar軟件對該毒株的F基因與GenBank登錄的10株國內(nèi)外NDV F基因核苷酸進(jìn)行比對，其同源性為81.1%～96.8%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為78%～86.6%，其中與GenBank登錄號(hào)為EF592508的黑龍江株同源性高達(dá)96.8%，與弱毒疫苗Lasota株的同源性只有81.1%。F基因的遺傳進(jìn)化樹分析顯示，該株與黑龍江毒株的遺傳距離最近(圖3)。但該株與Lasota株的同源性僅為81.1%，Lasota疫苗株免疫保護(hù)作用有待于進(jìn)一步研究。

本研究中該毒株與黑龍江強(qiáng)毒株的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性最高，遺傳進(jìn)化系譜樹分析兩者的親緣關(guān)系最近，推測該毒株與黑龍江強(qiáng)毒株一樣同屬于強(qiáng)毒株，這為該毒株的毒力和致病性判斷提供了分子生物學(xué)依據(jù)，這個(gè)推測與之前對NDV的生物學(xué)、免疫學(xué)特性以及NDV行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果相符[9]。推導(dǎo)的氨基酸序列比對中，在117位～142位氨基酸區(qū)間內(nèi)即融合多肽，NDV強(qiáng)毒株的融合多肽起始于苯丙氨酸(F)，而NDV弱毒株融合多肽起始于亮氨酸(L)，這也為NDV強(qiáng)弱毒的區(qū)分，從分子生物學(xué)角度提供了新的途徑。然而Morrison等通過構(gòu)建兩株NDV強(qiáng)毒株的突變體證實(shí)融合多肽的氨基端苯丙氨酸與融合作用無關(guān)，與F0的裂解有關(guān)[10]。

在序列比對中還發(fā)現(xiàn)，雖然所得到的NDV F基因的核苷酸序列的全長為1 662 bp，與所比對的序列大小一致，但在F基因的核苷酸668處有一個(gè)T插入，并在867處缺失了一個(gè)T(圖4)，該毒株和黑龍江參考毒株核苷酸同源性為96.8%，但推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性卻為86.6%。雖然兩者的遺傳關(guān)系最近，對于是否由于T的插入和缺失增強(qiáng)了該病毒對孔雀的易感性，還有待深入研究。

隨著畜禽業(yè)的發(fā)展，特種養(yǎng)殖在養(yǎng)殖業(yè)中的比例也不斷增加，目前我國的免疫大都只局限于家禽，由于火雞和孔雀的易感性較低[1]，所以忽視了對孔雀等珍禽的免疫。本研究從孔雀內(nèi)臟病料分離到NDV，通過病原學(xué)檢測及對SPF雞胚致病性指標(biāo)的測定，確定感染的為強(qiáng)毒株。該毒株極易成為家禽和其它野生鳥類的傳染源，因此提示特種畜禽的免疫工作也不可忽視，相關(guān)的病原感染來源及對其它鳥類的致病性等還有待進(jìn)一步研究。

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