內(nèi)源和外源性禽白血病病毒鑒別PCR檢測方法的建立

周 剛，牛成明，司昌德，韓凌霞

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬AL病毒(ALV)引起的禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過度增生的腫瘤性疾病[1]；ALV的感染還可引起雞群的免疫抑制[2]和生產(chǎn)力的嚴(yán)重下降。根據(jù)致病性和感染宿主的不同，ALV被劃分為A-J 10個(gè)亞群[3]，其中A-D亞群為外源性ALV，主要感染蛋雞，A、B亞群主要誘發(fā)雞的淋巴細(xì)胞白血病，而C、D亞群在野外極為少見；E～I(xiàn)亞群為內(nèi)源性ALV，其中E亞群為整合在雞染色體中一種前病毒DNA，在雞群中普遍存在[4]，而F～I(xiàn)亞群的宿主為野生禽類，包括雉、鷓鴣、鵪鶉和鷹等[5]。J亞群具有獨(dú)特的亞群特異性，主要引起肉雞的髓細(xì)胞瘤[6]。外源性ALV能誘發(fā)腫瘤，可垂直和水平傳播，而內(nèi)源性ALV的致瘤性很低，不能產(chǎn)生感染性病毒粒子[7]，但內(nèi)外源性ALV的重組將導(dǎo)致高致病性毒株的產(chǎn)生[8]。

近年來報(bào)道了多種ALV的檢測方法，但均無法區(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV[9]。本研究根據(jù)ALV各亞群共有的p27基因和決定ALV亞群特異性的env基因設(shè)計(jì)引物，建立了ALV的通用檢測并鑒別內(nèi)、外源性ALV的多重PCR檢測方法，以期為ALV的臨床診斷提供有效的手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株和主要試劑 A亞群ALV標(biāo)準(zhǔn)毒株(RAV-1)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病病毒(REV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)和DF-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體等均購自大連寶泰克生物有限公司；膠回收試劑盒、病毒RNA提取試劑盒等均購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自PAA公司。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ALV p27群通用型特異性引物序列按照文獻(xiàn)[8]合成，上下游引物分別為pF：5'-CCATGCCTGTAGTGATTA-3'和 pR：5'-CCCGAC CCAGTTTGTCCAT-3'，預(yù)期擴(kuò)增大小為 793 bp。外、內(nèi)源性ALV的特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)A亞群標(biāo)準(zhǔn)株RAV-1(DQ365814)和E亞群標(biāo)準(zhǔn)株ev1(AY01313)的env基因保守序列，外源性ALV的上下游引物分別為AF：5'-GACTTTACTGGCGGTCCT GA-3' 和 AR： 5'-CCCCACCTGTGAGCAGTTAT-3'，預(yù)期擴(kuò)增大小為387 bp；內(nèi)源性ALV的上下游引物分別為 EF：5'-ACACCTGTGGAGATGTGCAG-3'和ER：5'-GATCCACGCCCCTGATG-3'，預(yù)期擴(kuò)增大小為234 bp。RAV-1種毒通過DF-1細(xì)胞增殖，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(RAV-cDNA)后，利用p27基因和外源性ALV的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酚/氯仿法提取疑似感染內(nèi)源性ALV的雞胚基因組DNA(ALVE-DNA)，并利用內(nèi)源性ALV特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。膠回收p27基因、外源性和內(nèi)源性ALVenv基因的PCR擴(kuò)增片段，克隆于pMD18-T中構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序驗(yàn)證，重組質(zhì)粒分別命名為pp27、pA和pE。

1.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 在25 μL反應(yīng)體系下，以等濃度混合的(100 ng/μL)RAV-cDNA和ALVE-DNA為模板，固定引物AF、AR的濃度，將引物 EF、ER和 PF、PR的濃度在 5 pmol/μL～20 pmol/μL，退火溫度在48℃～60℃之間進(jìn)行調(diào)整，以確定多重PCR反應(yīng)的最佳引物濃度和退火溫度；在此基礎(chǔ)上將多重PCR的延伸時(shí)間在20 s～120 s之間進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳延伸時(shí)間。

1.4 多重PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn) 參考病毒RNA提取試劑盒說明書提取REV和IBDV的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并利用建立的多重PCR方法分別對RAV-cDNA和ALVE-DNA混合物、RAV-cDNA、ALVE-DNA、REV cDNA、IBDV cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測該方法的特異性。

1.5 多重PCR反應(yīng)的敏感性試驗(yàn) 用分光光度計(jì)測定RAV-cDNA和ALVE-DNA的濃度，并對各稀釋度(109copies/μL ～101copies/μL)的混合 DNA 進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測該方法的敏感性。

1.6 多重PCR反應(yīng)的初步應(yīng)用和符合性試驗(yàn) 采集現(xiàn)地一只疑似感染ALV的病死雞的肝臟、脾臟、腎臟、肺臟和心臟，以及10枚不同來源地的疑似感染內(nèi)源性ALV的雞胚，按常規(guī)方法提取基因組DNA，利用建立的多重PCR方法和IDEXX公司的ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒檢測內(nèi)、外源性ALV的感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 pp27、pA和pE重組質(zhì)粒的測序結(jié)果 1株pp27與親本株RAV-1、B亞群 RAV-2株(KO2374)、ALV-E ev1株的核苷酸序列同源性分別為100%、99.76%和98.24%；1株pA與RAV-1株、RAV-2株的核苷酸序列同源性分別為97.6%和98.6%，與ev1株的同源性僅為74%；1株pE與ALV-E ev3株(AY013304)、ev1株核苷酸序列同源性分別為99.76%和99.28%，與RAV-1、RAV-2株的同源性均為54%。

2.2 多重PCR最佳反應(yīng)條件的確定 經(jīng)過對各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定在25 μL PCR反應(yīng)體系中，濃度均為20 pmol/μL的p27、ALVA、ALVE引物各 0.6 μL、0.25 μL 和 0.125 μL；最佳退火溫度為50℃；最佳延伸時(shí)間為40 s。

2.3 多重PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn) RAV-cDNA和ALVE-DNA混合物擴(kuò)增出793 bp、387 bp和234 bp的特異性片段，RAV-cDNA僅擴(kuò)增出793 bp和387 bp的特異性片段，ALVE-DNA僅擴(kuò)增出793 bp和234 bp的特異性片段，而從REV和IBDV cDNA中均未擴(kuò)增出任何片段。表明建立的多重PCR方法具有良好的特異性(圖1)。

2.4 多重PCR反應(yīng)的敏感性試驗(yàn) 當(dāng)RAV-cDNA和ALVE-DNA的濃度均為103copies/μL時(shí)仍可得到清晰特異的片段，表明建立的多重PCR方法的靈敏度為 2×103copies(圖 2)。

2.5 現(xiàn)地樣品的檢測 肝、脾、腎和肺均擴(kuò)增出793 bp、387 bp和234 bp的特異性片段(圖3)，而9枚雞胚僅擴(kuò)增出793 bp和234 bp的特異性片段(圖4)，而且肝、脾、腎、肺和9枚雞胚的ELISA檢測結(jié)果均為陽性(S/P大于0.4)，與多重PCR的檢測結(jié)果完全符合，表明現(xiàn)地患病雞感染了外源性和內(nèi)源性ALV，而雞胚僅感染了內(nèi)源性ALV。

3 討 論

本研究選擇p27群特異性抗原的基因序列設(shè)計(jì)一對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了檢測ALV并鑒別外源性和內(nèi)源性ALV的多重PCR檢測方法，該方法可鑒定所有亞群的ALV，以此區(qū)分從臨床上難以鑒別的禽病，如禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥。由于ALV囊膜糖蛋白的編碼基因(env)容易發(fā)生變異，其在ALV外源性A、B、C、D亞群和內(nèi)源性E、J亞群中的同源性僅為40%[10]，因此，該方法將ALV A亞群標(biāo)準(zhǔn)毒株RAV-1和內(nèi)源性ALV ev1(ev基因座)的env基因作為靶基因設(shè)計(jì)2對特異性引物，可對外源性和內(nèi)源性ALV的感染進(jìn)行區(qū)分。本研究所建立的多重PCR方法具有特異、敏感、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，將為外源性ALV的臨床檢測、雞群的防制凈化及ALV的試驗(yàn)研究提供重要的手段。

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