豬流感病毒血凝素研究進展

謝金文,沈 旭,沈志強

2.山東綠都生物科技有限公司

豬流感病毒血凝素研究進展

謝金文1,2,沈 旭2,沈志強1,2

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豬流行性感冒,簡稱豬流感(Swine influenza,SI),是豬的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。自美國1918年首次報道本病以來,歐、美、亞、非、澳等世界各大洲均有本病的發(fā)生和流行。SI能引起豬的高發(fā)病率(幾乎100%)和低死亡率(病死率≤1%)。此病的發(fā)生可使患病豬生產(chǎn)性能下降,推遲上市;還可引起呼吸道細菌和病毒繼發(fā)或混合感染,使疫情更為嚴重,造成豬只死亡。其病原為豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV),屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,病毒粒子呈多形態(tài),不過多數(shù)呈球形,直徑約80-120nm。個別絲狀體可長達數(shù)微米,常見于剛分離到的病毒顆粒,雞胚或細胞內(nèi)反復傳代繁殖后變?yōu)榍蛐巍２《居心夷?由雙層類脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白組成。囊膜表面有許多放射狀排列的突起,即纖突和刺突。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼,呈螺旋狀對稱,直徑為10nm。兩端具有環(huán)狀結構,存在于病毒的囊膜內(nèi)。

1 SIV的基因組結構

SIV是單股負鏈 RNA病毒,基因組約為13.6kb,是由大小不等的8個獨立片段組成。在所有的基因片段中,5′端的前13個核苷酸都相似,序列為 GGAACAAA-GAUGAppp5′,3′端的 12 個核苷酸也高度保守,其序列為HO-UCGU(C)UUUCGUCC-C〔1〕。8個基因片段編碼10個基因產(chǎn)物,片段1和片斷2最大,為2 341個核苷酸,分別編碼不同長度的PB2和PB1聚合酶。片段3編碼PA聚合酶,片段4、片段5和片段6分別編碼血凝素(HA)、核衣殼蛋白(NP)和神經(jīng)氨酸酶(NA),片段7有3個讀碼框,編碼基脂蛋白(M1、M2和M3)。轉錄出的MlmRNA和M2mRNA的5′端序列相同,并且共用翻譯起始密碼,故 M1和 M2的前9個氨基酸是相同的。M3是一個連續(xù)的小mRNA,翻譯能力有限,目前人們還沒有分離到這一短肽,因此一些文獻甚至不提M3。片斷8最小,僅為890個核苷酸,該片段有2個開放閱讀框,分別編碼非結構蛋白 NS1 和 NS2〔1-3〕。

2 SIV HA的結構與功能

HA是病毒主要的表面糖蛋白,屬于典型的I型糖蛋白,是構成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,為桿球形蛋白分子,大小為4nm×14nm,在電鏡下可形成星狀聚合物。HA分子量為75kD,大約由562-566個氨基酸組成。HA含有4個結構域:信號肽、胞漿域、跨膜域和胞外域。HA在適宜條件下能凝集某些動物的紅細胞。大多數(shù)情況下,血凝素均為熱不穩(wěn)定性,有報道稱 60℃10min即可被滅活〔4〕。

IV基因組中HA和NA的變異頻率最高,每個核苷酸在復制周期中,HA基因的變異頻率可達2×10-3,是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感病毒的血凝素(HA)有16個亞型〔5〕,神經(jīng)氨酸酶(NA)有9個亞型,而發(fā)現(xiàn)的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7 、H3N2、H2N3〔6〕、H3N1〔7〕、H3N6、H4N6、H5N1和 H9N2共 10種不同的亞型,但常見的只有 H1N1、H1N2、H3N2 等 ,其他血清型只有零星報道。

流感病毒的HA包括3個高度保守的半胱氨酸殘基,靠近HA2亞單位羧基端棕櫚化位點。功能性HA是由3個非共價結合的HA1和HA2肽鏈所組成,兩者之間以一個精氨酸相連。HA1由328個氨基酸組成,HA的大部分抗原決定簇集中在HA1上,因此,HA1具有 HA的主要抗原性。SIV受體是位于細胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白,由位于流感病毒HA蛋白N端的受體結合部位HA1區(qū)與宿主細胞膜表面唾液酸受體末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸結合,使病毒附著于易感細胞表面,所以HA1對SIV侵入宿主細胞有重要意義?？偟膩碚fHA1具有與宿主細胞受體結合的特性。HA2由221個氨基酸組成,是參與和細胞融合的重要亞單位。HA水解成HA1和HA2,是感染的先決條件,水解后則去除連接肽或單一精氨酸。這在不同的宿主細胞是不同的。因此,HA對細胞蛋白酶的易感性和這些酶在宿主組織中的分布是病毒泛嗜性的決定因素。

SIV進入宿主細胞依賴于病毒囊膜與細胞膜的融合。HA在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用。利用HA抗體,可以分析和觀察HA的結構及其與受體的結合。HA以三聚體的形式鑲嵌在雙層類脂膜上,每個HA單體可分成兩部分,一部分由HA1構成的球形頭部,含有受體位點和抗原決定簇;另一部分為柄,由HA1一部分和整個HA2組成,插入囊膜。SIV的受體是位于細胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白,而SIV的HA頭部最外面是半乳糖,半乳糖和細胞膜上的受體相結合,從而使SIV感染細胞。SIV感染細胞后,SIV的HA2的N端融合序列(N-Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-A1a-Gly-Phe-Ile-Glu-Gly-Gly-)裸露出來并與細胞質(zhì)膜發(fā)生融合,病毒基因組釋放到細胞漿內(nèi),開始病毒復制〔1,8〕。

HA的膜融合作用除了需要蛋白酶的裂解外,還需要酸性環(huán)境。而這種融合作用是由于病毒HA在低pH誘導下變?yōu)榫哂腥诤匣钚缘臉嬒?。羅漢松酸相關的復合物通過與A型流感病毒的中性pH構象相互作用,可以阻止低pH誘導HA變?yōu)槿诤闲詷嬒蟆０麧{域由10-11個氨基酸組成,其中5個氨基酸殘基在A型流感病毒的所有亞型中都是保守的。乙?；稽c的減少可阻止HA1亞型感染性病毒的形成。去乙?；饔貌挥绊懩さ娜诤虾腿诤峡椎男纬?但可抑制合胞體的形成〔3,9-10〕。

SIV的HA受體結合部位呈口袋狀,其位點相當?shù)谋Ｊ?如98位上的Tye,153位的 Trp,183位的His,190位的Glu,194位的 Lue;另外,這一位點周圍的一些氨基酸也比較保守,如99位的Pro,97位的Lys,14位的Pro等。如果受體位點上的某個氨基酸發(fā)生變異不僅能引起抗原性變異,還能改變受體和病毒的結合能力〔1〕。有研究報道,HA序列的第226位氨基酸決定病毒的宿主特異性,當豬流感病毒第226位的氨基酸為蛋氨酸(M)時,病毒就具有感染禽的潛力。

HA基因在流感病毒識別靶細胞表面受體及穿膜過程中起重要作用,刺激機體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染,還可以刺激機體產(chǎn)生細胞毒性淋巴細胞(CT L)反應。因此,對HA基因編碼的蛋白的研究具有重要意義。

3 國內(nèi)外的相關研究

陳艷等〔11-12〕以豬源 H1N1 SIV的HA基因為目的基因,構建了原核重組表達載體pET-HA,并對重組蛋白的表達條件進行了優(yōu)化,使目的蛋白以包涵體的形式獲得高水平的表達,同時對重組蛋白的抗原性進行了研究,以HA重組蛋白為抗原進行的間接ELISA,初步試驗表明表達的重組HA蛋白具有良好的抗原反應性,為建立 H1亞型豬流感抗體間接ELISA診斷方法奠定了基礎,并可作為已建立豬流感通用型抗體檢測方法的一個補充,同時為HA基因表達蛋白監(jiān)測血清中的抗體水平提供科學依據(jù)。

周慶豐等〔13〕用原核表達載體表達的SIV HA蛋白都是包涵體,表達量低,可溶性也很低,需要通過包涵體的變性復性來進行純化,但這樣很可能改變了表達蛋白的生物學活性。張祥斌等〔14〕選用pBCX高效可溶表達載體高效表達H1N1亞型SIV的HA蛋白,表達量占菌體總蛋白的29.5%,且大部分以可溶形式表達,這給目的蛋白純化提供了方便。經(jīng)Western-blot分析證實可溶表達的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫反應性。用純化的 HA融合蛋白作包被抗原用于豬流感病毒單克隆抗體的篩選,成功篩選到2株針對HA蛋白抗原表位的單克隆抗體;ELISA結果表明,制備的SIV單克隆抗體ⅢF6A4C10與H1N1亞型SIV抗原具有特異的免疫反應性,為H1N1 SIV的鑒別診斷奠定了基礎。

尹可等〔15〕將 H5亞型SIV HA1基因克隆到原核表達載體pET-28a(+)中進行了原核表達,HA1蛋白在表達系統(tǒng)中也主要以包涵體形式表達。表達的蛋白能被抗His單克隆抗體和抗H5亞型SIV陽性血清特異識別。并以鎳螯合層析純化表達蛋白,通過優(yōu)化反應條件,建立了基于HA1重組蛋白的H5亞型SIV抗體間接ELISA(iHA1-ELISA)檢測方法。該方法對H5亞型SIV抗體具有良好的特異性,與傳統(tǒng)HI方法與傳統(tǒng)HI方法具有較高的符合率。劉天強等〔16〕也進行了該方面的工作,與尹可等的實驗結果稍稍不同的是在ELISA與HI方法的比較試驗中,ELISA對SIV抗體陽性檢出率高于傳統(tǒng)HI方法。與其他血清學診斷方法相比,間接ELISA檢測方法具有快速、試驗要求不高、不需要無菌操作、操作簡單、可短時間內(nèi)檢測大量樣品等優(yōu)點,適于普通實驗室的SIV血清學診斷、海關檢疫及大規(guī)模普查等。

李洪濤等〔17〕構建了H1亞型豬流感病毒 A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表達質(zhì)粒,基因免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠,加強免疫后取其脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0進行融合,通過ELISA、HI試驗篩選陽性克隆,應用ELISA、HI試驗和Western blot試驗測定mAb的反應性和特異性。結果共獲得3株分泌抗H1亞型豬流感病毒HA蛋白的雜交瘤細胞株,并分別命名為8C4、8C6、9D6。mAb腹水ELISA 效價在1∶16 000～1∶256 000之間;HI效價為1∶512～1∶256 000;對A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效價分別為 :10-2.83、10-6.4、10-5.8。Westernblot分析結果顯示,3株mAb只與H1亞型豬流感病毒 HA蛋白反應。

彭金美等〔18〕構建了含禽流感病毒HA、NP基因表位表達載體,對雛雞免疫并攻毒,存活雞HI抗體效價顯著增高,流式細胞儀檢測顯示外周血CD4,CD8T細胞在免疫后都有不同程度的升高,對H5N1強毒攻擊保護率達50%以上。

劉惠莉等〔19〕成功構建表達了含有SIV H1N1、H3N2亞型HA基因T、B抗原表位的模擬蛋白,構建的串聯(lián)表位基因包含了來源于SIV H1N1、H3N2HA基因的T、B表位抗原,可同時誘導機體T、B淋巴細胞反應,具備理想疫苗的特性。且串聯(lián)了通用T細胞表位,可誘導機體Th細胞免疫學反應,以充分調(diào)動全身免疫系統(tǒng),最大限度發(fā)揮機體免疫效果。Jeon等〔20〕串聯(lián)表達了 HA、NP蛋白的 B細胞的表位、輔助性T細胞表位,將此翻譯肽段免疫小鼠后產(chǎn)生了體液免疫和輔助性T細胞反應,小鼠可抵抗致死性病毒的攻擊,并迅速得以康復。陳義鋒等〔21〕串聯(lián)表達和動物流感HN、NA抗原表位,免疫小鼠,ELISA檢測具有較好的免疫原性,為進一步探討其作為表位疫苗的可行性奠定了基礎。Stoloff等〔22〕通過合成多個表位,擬研制對各種血清亞型流感病毒均有效果的通用疫苗,為預防控制流感病毒大流行做好了技術儲備。

所有這些為SIVHA抗原變異分析、豬流感診斷方法的建立以及豬流感病毒亞型的鑒定等奠定了一定的物質(zhì)與技術基礎。

〔1〕伍銳,金梅林,陳煥春,等.豬流感病毒研究進展〔J〕.動物醫(yī)學進展,2004,25(1):25-28.

〔2〕殷震,劉景華.動物病毒學〔M〕.2版.北京:科學出版社,1997:704-730.

〔3〕呂翠,馬小明,尹燕博,等.豬流感病毒研究進展〔J〕.動物醫(yī)學進展,2008,29(11):60-63.

〔4〕王連想,畢英佐,曹永長.豬流感病毒廣東株的分離鑒定及其特性〔J〕.中國獸醫(yī)科技,2003,33(2):17-21.

〔5〕Fouchier R A,M unstert V,Wallensten A,et al.Characterizaiton of a novel influenza A virus hemagglutin in subtype(H16)obtained from black-headed gulls〔J〕.J Virol,2005,79:2814-2822.

〔6〕M a W,Vincent AL,Gramer M,et al.Identification of H2N3 influenza A viruses from swine in the United States〔 J〕 .Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(52):20949-20954.

〔7〕Ma W,Gramer M,Rossow K,et al.Isolation and genetic characterization of new reasso rtant H3N1 swine influenza virus from pig s in the midwestern United States〔J〕.J Virol,2006,80(10):5092-5096.

〔8〕Fields B N,Knipe D M,Howley P M,et a1.Fields virology〔M〕.Lippincott-Raven publishers,Phildelphia,1996:1353-1395.

〔9〕吳仁蔚,胡思順,肖運才,等.檢測禽流感病毒抗體的重組核蛋白間接ELISA方法的建立〔J〕.畜牧獸醫(yī)學報,2006,37(10):1067-1072.

〔10〕Steinhauer D A.Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus〔J〕.Virology,2006,258(1):1-20.

〔11〕陳艷,喬傳玲,丁選亞,等.豬流感病毒血凝素基因原核表達及其在間接ELISA中的初步應用〔J〕.畜牧與獸醫(yī),2008,40(11):10-13.

〔12〕陳艷,辛曉光,楊煥良,等.豬流感抗體間接 ELISA檢測方法的建立〔J〕.中國預防獸醫(yī)學報,2007,4:308-311.

〔13〕周慶豐,馬靜云,曹永長,等.H1亞型豬流感病毒廣東株HA基因的原核表達〔J〕.華南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版,2007,28(1):105-108.

〔14〕張祥斌,謝青梅,馬靜云,等.H1N1亞型豬流感病毒HA基因的表達及單克隆抗體的制備〔J〕.中國獸醫(yī)科學,2008,38(11):962-967.

〔15〕尹可,郭軍慶,黃杰,等.H5亞型豬流感病毒 HA1重組蛋白的制備及間接ELISA檢測方法的建立〔J〕.中國獸醫(yī)科學,2008,38(9):762-766.

〔16〕劉天強,于海,張強,等.H3N2亞型豬流感病毒血凝素基因的原核表達及間接ELISA診斷方法的建立〔J〕.中國預防獸醫(yī)學報,2008,30(10):795-823.

〔17〕李洪濤,劉明,劉春國,等.豬流感病毒H1亞型HA蛋白特異性單克隆抗體的研制〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2009,25(3):233-235.

〔18〕彭金美,童光志,王石峰,等.抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的構建及其免疫效力研究〔J〕.生物工程學報,2003,9(19):623-627.

〔19〕劉惠莉,邢繼蘭,潘潔,等.豬流感病毒抗原表位基因表達載體構建與免疫原性分析〔J〕.生物工程學報,2008,24(4):690-694.

〔20〕Jeon SH,Ben-Yedidia T,Arnon R,et al.Intranasal immunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus〔J〕.Vaccine,2002,20(21-22):2772-2780.

〔21〕陳義鋒,金寧一,賈雷立,等.H3、H5、H7、H9 亞型流感病毒通用多表位重組雞痘病毒構建〔J〕.免疫學雜志,2007,5(23):524-527.

〔22〕Stoloff GA,Caparros-Wanderley W.Synthetic multi-epitope peptides identified in silico induces protective immunity against multiple influenza serotypes〔J〕.Eur J Immunol,2007,37(9):2441-2449.

R373.1

A

1002-2694(2010)01-0088-03

1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 預防獸醫(yī)學與動物生物技術重點實驗室,濱州 256600;

2009-05-14;

2009-09-16