大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63毒性檢測(cè)及佐劑效果研究*

白雪飛,郭靜玉,雷萬(wàn)軍,段廣才

大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63毒性檢測(cè)及佐劑效果研究*

白雪飛,郭靜玉,雷萬(wàn)軍,段廣才

目的對(duì)已構(gòu)建的大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63進(jìn)行表達(dá)、純化、毒性檢測(cè),并對(duì)其佐劑活性進(jìn)行研究。方法 采用已知的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析、純化濃縮后,進(jìn)行毒性檢測(cè)。將純化后的mLT63聯(lián)合幽門螺旋桿菌(Hp)亞單位疫苗UreB、Omp11經(jīng)口途徑免疫BALB/c小鼠,免疫后取血清、胃組織提取液、糞便提取液進(jìn)行ELISA試驗(yàn),檢測(cè)其中的特異性抗體水平,將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 經(jīng)家兔回腸袢毒性試驗(yàn)驗(yàn)證本室構(gòu)建大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63沒有毒性,mLT63聯(lián)合Hp亞單位疫苗UreB、Omp11免疫小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)mLT63具有佐劑活性。結(jié)論 本室構(gòu)建、表達(dá)的大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63無(wú)毒,并具有免疫佐劑的活性。

大腸桿菌不耐熱腸毒素;突變體;佐劑

Email:baix uefei2003@126.com

應(yīng)用生物技術(shù)得到的純化抗原往往在粘膜表面接種時(shí)免疫原性較弱,并且容易誘導(dǎo)免疫耐受。為加強(qiáng)局部粘膜免疫,激活粘膜免疫應(yīng)答,使疫苗發(fā)揮最大作用,可通過在疫苗中加入適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┻M(jìn)行免疫接種。較理想的粘膜佐劑應(yīng)該高效、安全,能激活粘膜免疫系統(tǒng),在其存在的情況下抗原經(jīng)粘膜供給可引發(fā)抗原特異性的全身和粘膜局部的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin,LT)是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichia coli,ET EC)產(chǎn)生的一種對(duì)熱敏感的毒素,是引起人及哺乳動(dòng)物腹瀉的主要因素之一。LT是迄今為止發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的免疫原之一,并且具有很好的粘膜免疫佐劑作用,它能通過增加抗原的攝入和呈遞,有效地在粘膜水平提高免疫原性,還能誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟和免疫刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔1〕。此外,LT不能誘導(dǎo)耐受并且能夠中止耐受誘導(dǎo)。但LT的高毒性限制了它的應(yīng)用,利用基因工程構(gòu)建的LT無(wú)毒衍生物突變體能夠彌補(bǔ)這樣的不足。LT第63位氨基酸突變,使絲氨酸誘變?yōu)橘嚢彼?使得LTA失去NAD蛋白結(jié)合位點(diǎn),即可無(wú)毒并具有較強(qiáng)的免疫原性和佐劑性,極有可能成為適用于人體的粘膜免疫佐劑〔2〕。本研究對(duì)已構(gòu)建的 TB1(pMAL-c2X-mlt)原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)及純化,并將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行毒性檢測(cè)和佐劑活性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 基因工程重組菌 TB1(pMAL-c2X-mlt)由申曉靖等人構(gòu)建并保存〔3〕。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白家兔(CV級(jí)),購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雌性,4kg。6-8周齡BALB/c小鼠30只(CV級(jí)),雌雄各半,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要儀器 DYY-Ⅲ型垂直電泳槽(北京六一儀器廠),半干式電轉(zhuǎn)移槽(BIORAD公司),JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所),凝膠圖像分析儀(美國(guó)syugene),直鏈淀粉親和層析預(yù)裝柱(New England Biolabs公司)。

1.1.4 主要試劑 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、β-巰基乙醇、四甲基已二胺(TEMED)等購(gòu)自Sigma公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自 Roche公司,IPTG購(gòu)自TaKaRa公司,兔抗霍亂毒素(CT)購(gòu)自Sigma公司,羊抗兔HRP-IgG購(gòu)自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TB1(pMAL-c2X-mlt)的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定過的陽(yáng)性克隆菌落接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振搖過夜,取50μ L菌液加入5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振搖至對(duì)數(shù)中期,加入 IPTG誘導(dǎo)。TB1(pMAL-c2X-mlt)在37 ℃、pH 7.5-8.0、IPTG 濃度為 0.2 mmol/L、不含葡萄糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6h能夠達(dá)到最大的表達(dá)量〔4〕。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的處理 將大量誘導(dǎo)完成后的菌液進(jìn)行超聲粉碎、鹽析沉淀,得到的蛋白粗提物進(jìn)行親和層析純化,純化后的mLT63進(jìn)行蛋白定量,確定終濃度。

1.2.3 融合蛋白的毒性檢測(cè) 日本大耳白家兔禁食24 h后,局部常規(guī)消毒鋪巾,乙醚麻醉,沿腹正中線開腹,選擇回腸袢,沿回盲部向上行走4-6cm開始結(jié)扎,共結(jié)扎8段,每段5 cm,每?jī)啥沃g間隔5 cm,每段腸管均注入0.5mL樣品,并標(biāo)記順序,關(guān)腹,具體樣品量見表1。家兔繼續(xù)禁食24 h后,氯仿麻醉處死,剖腹觀察回腸袢外觀,抽取每段腸管內(nèi)的液體,計(jì)量做比較。采用本室純化的LT(0.5 mg/mL)做為陽(yáng)性對(duì)照。

表1 家兔回腸袢結(jié)扎段注入樣品及編號(hào)Table 1 Different sample and content in each loop

1.2.4 融合蛋白的佐劑活性檢測(cè) 將 30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組,A、B、C組每組各10只,A組為 rUreB、rOmp11、mLT63經(jīng)口免疫組,B組為 rUreB、rOmp11經(jīng)口免疫組,C組為 column buffer對(duì)照組。

A組:每次經(jīng)口灌胃 rUreB 10μ g,rOmp11 10μ g,mLT63 10μ g,200μ L/只 。

B組:每次經(jīng)口灌胃 rUreB 10μ g,rOmp11 10μ g,200μ L/只 。

C組:每次經(jīng)口灌胃column buffer,200μ L/只。

免疫接種前將各組小鼠禁食12 h,禁水4 h,灌胃組3%NaHCO3100μ L灌胃中和胃酸,30min后各組分別按照上述免疫物質(zhì)及劑量進(jìn)行免疫。在實(shí)驗(yàn)開始的第1、21 d各免疫1次,免疫結(jié)束4 h后恢復(fù)食水。

末次免疫2w后,A、B、C組各10只小鼠均摘除眼球取血;頸椎脫臼處死后,75%酒精消毒,剖腹取胃組織,同時(shí)收集新鮮糞便,Elisa法測(cè)定血清、胃液、糞便提取物中的特異性抗體水平。應(yīng)用SAS 9.13統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,評(píng)價(jià)抗原和佐劑組合的免疫應(yīng)答效果。

2 結(jié) 果

2.1 mLT63的毒性檢測(cè) 陰性對(duì)照組:1、2段腸腔外觀無(wú)異常,腸腔內(nèi)幾乎無(wú)液體。陽(yáng)性對(duì)照組:3、4、5段腸腔均充血水腫,腸腔內(nèi)積液約有8～9mL。實(shí)驗(yàn)組:6、7、8段腸腔外觀無(wú)異常,腸腔內(nèi)幾乎無(wú)液體。(圖 1,2)

2.2 mLT63的佐劑活性檢測(cè) 根據(jù)ELISA檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn),血清、胃液、糞便提取物中重組蛋白特異性IgG、sIgA結(jié)果如下表。

圖1 注入0.1 g LT的腸段Fig.1 Rabbit ileum loop which injected in 0.1 g LT圖2 對(duì)照腸段:腸段 1內(nèi)注入 50 g mLT63腸段 2內(nèi)注入 column bufferFig.2 Rabbit ileum loop 1 which injected in 50 g mLT63.The number 2 which injected in column buffer

表2 各組小鼠血清、胃液及糞便提取物中的特異性抗體的表達(dá)±s)Table 2 Expression of specific antibodies in serum,gastric juice and extractions of dejecta in different groups(±s)

表2 各組小鼠血清、胃液及糞便提取物中的特異性抗體的表達(dá)±s)Table 2 Expression of specific antibodies in serum,gastric juice and extractions of dejecta in different groups(±s)

組別 血清(IgG) 胃液(sIgA) 糞便提取物(sIgA)A 1.7051±0.2947 0.8497±0.3583 1.9012±0.2277 B 1.0875±0.1173 0.4582±0.1864 0.7210±0.0524 C 0.0798±0.2165 0.4326±0.1500 0.6859±0.1377

各組資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布;單因素方差分析顯示:組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。①小鼠血清中特異性IgG結(jié)果顯示:A、B、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②小鼠胃液中特異性sI-gA結(jié)果顯示:A組高于B、C組(P＜0.05),B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③小鼠糞便提取物中特異性sI-gA結(jié)果顯示:A、B、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討 論

粘膜佐劑是經(jīng)粘膜免疫的疫苗中的重要組分。許多接種失敗的疫苗中通過加入適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┠軌蝻@著提高免疫接種效果。作為L(zhǎng)T的無(wú)毒突變體mLT63具有無(wú)毒、免疫原性好等特點(diǎn),可作為候選疫苗佐劑。本研究室構(gòu)建了以pMAL-c2X為載體,TB1為工程菌的原核表達(dá)系統(tǒng),并通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,已能夠?qū)崿F(xiàn)TB1(pMAL-c2X-mlt)的高效表達(dá),經(jīng)親和層析純化獲得了高純度的mLT63。

家兔回腸袢毒性試驗(yàn)是檢測(cè)腸毒素的常用方法〔5〕。毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,100ng的LT可導(dǎo)致家兔回腸袢腸段充血水腫,而50μ g的mLT63對(duì)家兔回腸袢腸段無(wú)任何毒性作用。充分證明我們所構(gòu)建、表達(dá)的mLT63沒有毒性。Hp亞單位疫苗是經(jīng)粘膜免疫的疫苗之一,非粘膜途徑的免疫接種幾乎無(wú)免疫保護(hù)作用。Hp尿素酶(Urease,Ure)是Hp定植和致病的關(guān)鍵因素,也是H p重要的毒力因子之一。尿素酶B亞單位(UreB)缺乏尿素酶活性并保留了免疫原性,其編碼基因高度保守,因此成為Hp疫苗的重要候選抗原之一〔6〕。多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜蛋白具有良好的抗原活性,可作為抗體和免疫細(xì)胞攻擊的主要靶標(biāo),介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌最直接有效的殺滅作用。Omp11是Hp的一種外膜蛋白,其編碼基因具有高度保守性,有望成為Hp疫苗的重要免疫抗原〔6〕。因此,在本研究中應(yīng)用Hp抗原rUreB、rOmp11聯(lián)合mLT63經(jīng)口途徑免疫BALB/c小鼠,研究結(jié)果表明:mLT63聯(lián)合 rUreB、rOmp11經(jīng)口免疫BALB/c小鼠所引起的免疫應(yīng)答高于抗原組及對(duì)照組,從而證實(shí)我們所構(gòu)建表達(dá)的大腸桿菌無(wú)毒突變體mLT63具有良好的免疫佐劑活性。在研究過程中,無(wú)一例小鼠發(fā)生腹瀉、精神萎靡等現(xiàn)象,說明了mLT63作為疫苗佐劑的安全性。

通過本研究,我們對(duì) TB1(pMAL-c2X-mlt)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),純化產(chǎn)物經(jīng)家兔回腸袢實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)為無(wú)毒性,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了所構(gòu)建、表達(dá)的mLT63具有良好的佐劑活性。

〔1〕Verweij WR,Haan L,Holtrop M,et al.Mucosal immunoadjuvant activity of recombinantEscherichia coliheat-labile enterotoxin and its B subunit:induction of sy stemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with influenza virus surface antigen〔J〕.Vaccine,1998,16(20):2069-2076.

〔2〕Parez N,Fourgeux C,M ohamed A,et al.Rectal immunization with rotavirus virus-like particles induces sy stemic and mucosal humoral immune responses and protects mice against rotavirus infection〔J〕.Virol,2006,80(4):1752-1761.

〔3〕申曉靖,段廣才,郗園林,等.大腸桿菌不耐熱腸毒素基因克隆和無(wú)毒突變體mLT63的構(gòu)建及序列分析〔J〕.河南醫(yī)學(xué)研究,2005,14(2):100-103.

〔4〕白雪飛,郗園林,段廣才.大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)無(wú)毒突變體mLT63在大腸桿菌中的融合表達(dá)及純化〔J〕.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(9):821-824.

〔5〕Park KS,Ono T,Rokuda M,et al.Cytotoxicity and enterotoxicity of the thermostable direct hemoly sin-deletion mutants of Vibrio parahaemoly ticus〔J〕.Microbiol Immunol,2004,48(4):313-318.

〔6〕Keenan JI,Allardyce RA,Bagshaw PF.Lack of protection following immunisation withH.py lorimembrane vesicles highlights antigenic differences betweenH.felisandH.pylori〔J〕.FEM S Microbiol Lett,1998,161(1):21-27.

Toxicity detection of heat-labile enterotoxin in non-toxic mutant ofEscherichia coliand investigation on its adjuvant effect ofE.coliheat-labile enterotoxin

BAI Xue-fei,GUO Jing-yu,LEI Wan-jun,DUAN Guang-cai

(HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang410003,China)

In the present study,the expression,purification,toxicity detection and the adjuvant effect of the heat-labile enterotoxin in non-toxic mutant mLT63 ofEscherichia coliwere investigated,in which the inductive expression was performed under optimal condition for inductive expression and the toxicity of the products obtained from inductive expression were tested for toxicity after being purified and concentrated with affinity chromatography.BALB/c mice were immunized orally with the mutant mLT63 associated withHelicobacter pylori(Hp)subunit vaccine UreB,Omp11.After immunization,the specific antibody levels in serum,extract from gastric tissues and fecal extract were determind by means of ELISA assay and the results were subjected to statistical analysis.It was demonstrated that the mutant mLT63 of heat-labile entrotoxin ofE.coliconstructed in our laboratory devoided of any toxic effect as revealed by the rabbit ileal loop assay,but its adjuvant effect could be demonstrated in the associated immunization of mice withHpsubunit vaccine UreB and Omp11.

Escherichiacoliheat labile enterotoxin;mutants;adjuvant

R478.99

A

1002-2694(2010)01-0069-03

*河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2008A310005)

河南科技大學(xué),洛陽(yáng) 471003;

2009-05-16;

2009-10-18