布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展*

高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展*

高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種重要人獸共患病。根據(jù)致病性和宿主特異性,將布魯氏菌分為6個(gè)種19個(gè)生物型,即羊種布魯氏菌(B.meltensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)、犬種布魯氏菌(B.canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)。另外,從海洋動(dòng)物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的布魯氏菌,定為海洋種布魯氏菌(B.maris)。據(jù)中國CDC報(bào)告,2005-2008年全國布魯氏菌病新發(fā)病人分別為 18 416、19 013、21 901、30 002 例 ,人布魯氏菌病發(fā)生嚴(yán)重,形勢十分嚴(yán)峻。流行病學(xué)調(diào)查表明,感染來源主要是患布魯氏菌病的羊,其次是牛及其它動(dòng)物。因此加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的檢疫監(jiān)測力度十分重要。本文就布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展作一綜述。

1 免疫學(xué)診斷技術(shù)

1.1 血清凝集性試驗(yàn) 布魯氏菌病傳統(tǒng)檢測方法有血清凝集試驗(yàn)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)(MRT)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb's)等。經(jīng)典血清凝集試驗(yàn)包括標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(SAT)和平板凝集試驗(yàn)(PAT)等在發(fā)達(dá)國家已基本上停止使用,取代方法是緩沖布魯氏菌抗原試驗(yàn),如虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)等。虎紅平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌株經(jīng)培養(yǎng)、滅活、離心后用虎紅染色液染色,懸浮于乳酸緩沖液中制成。RBT特異、敏感、價(jià)廉、操作簡便,在國際貿(mào)易中,緩沖布魯氏菌抗原試驗(yàn)是牛、羊、豬種布魯氏菌病的指定試驗(yàn)。在我國,RBT也用于人布魯氏菌病的監(jiān)測的初篩試驗(yàn)。乳牛MRT依然是乳牛布魯氏菌病監(jiān)測的主要方法。由于凝集性試驗(yàn)是基于檢測針對(duì)布魯氏菌多糖O-鏈的抗體,因此會(huì)與有類似多糖O-鏈的細(xì)菌如耶爾森氏菌O∶9等出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

1.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT) CFT至今仍是布魯氏菌病診斷的重要方法,是牛、羊及綿羊附睪種布魯氏菌病國際貿(mào)易指定試驗(yàn),并作為確診用。Adone等〔1〕以無抗補(bǔ)體活性的羊種布魯氏菌B115 R型菌株為抗原建立檢測抗體的CFT(B115-CFT),并通過對(duì)RB51免疫的牛和水牛、綿羊附睪種布魯氏菌感染的羊和犬種布魯氏菌感染的犬血清中R型抗體進(jìn)行檢測表明,B115-CFT與RB51-CFT和HSE(布魯氏菌熱鹽抽提物)-CFT相比,具有很高的敏感性和特異性。由于豬的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的敏感性降低38%～40%,因而CFT不適合豬種布魯氏菌病的檢測。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA是一種與CF T效果相當(dāng)?shù)姆椒?操作更方便,既可以作為確定檢測,又可以作為篩選和鑒別用。但只有用于牛布魯氏菌病的ELISA是國際貿(mào)易指定的,這種ELISA方法不僅用于血清學(xué)診斷,還可用于乳汁檢查〔2〕。用于其他種布魯氏菌病檢測的ELISA方法也是研究的熱點(diǎn)。Fel＇dsherova等〔3〕應(yīng)用鼠抗流產(chǎn)布魯氏菌脂多糖(LPS)的單克隆抗體建立了用于牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌和豬種布魯氏菌鑒定的ELISA,該法具有高度的特異性和敏感性,同時(shí)不與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3、O∶9及鼠傷寒沙門氏菌和土拉熱弗朗西斯氏菌反應(yīng)。檢測抗原的最低濃度可達(dá)0.05-0.1 ng/mL。Nielsen等〔4〕應(yīng)用抗牛種布魯氏菌S1119.3株S-LPS的O糖鏈(OPS)共同抗原表位且不與蛋白A/G結(jié)合的特異性單克隆抗體建立了第二代競爭ELISA(CELISA),該方法通過單克隆抗體與牛被檢血清中的抗體與S-LPS的競爭結(jié)合,用酶標(biāo)蛋白A/G顯色來進(jìn)行檢測。方法特異、敏感,并能區(qū)分牛種布魯氏菌S19疫苗株免疫。Cakan等〔5〕應(yīng)用商品化布魯氏菌病IgG ELISA和IgM ELISA試劑盒對(duì)人布魯氏菌病進(jìn)行檢測表明,當(dāng)IgG ELISA和IgM ELISA同時(shí)應(yīng)用時(shí),對(duì)于疾病的診斷具有很高的敏感性。ELISA的效果關(guān)鍵在于抗原的選用。標(biāo)準(zhǔn)化牛種布魯氏菌病ELISA檢測方法使用了S-LPS抗原。

1.4 免疫組化法(Immunochemistry) Ilhan等〔6〕應(yīng)用免疫組化法檢測了羊種布魯氏菌抗原在流產(chǎn)胎兒組織中的存在與分布情況。在110份流產(chǎn)胎兒樣本中檢出抗原的有33份(占30%)。33份陽性樣本中檢測到抗原的,肺25份(占 22.7%),肝 21份(占19%),脾13份(占 11.8%),腎 6份(占5.4%)。抗原主要位于肺巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及肝枯否氏細(xì)胞的細(xì)胞膜上。結(jié)果證明,免疫組化法可用于羊種布魯氏菌引起的綿羊流產(chǎn)福爾馬林固定樣本的檢測。

1.5 膠體金免疫層析檢測技術(shù)(GICA) Kim等〔7〕用犬種布魯氏菌的抽提物作為檢測抗原建立了檢測犬血清布魯氏菌病抗體的GICA。分別用血液培養(yǎng)、2-巰基乙醇快速篩選凝集試驗(yàn)(2-ME RSAT)和GICA對(duì)發(fā)生布魯氏菌病的10個(gè)不同圈舍的犬群進(jìn)行檢測,陽性率分別為24.8%,39.5%和39.1%,2-ME RSAT和GICA之間的κ值為0.89。結(jié)果表明GICA與常規(guī)的凝集試驗(yàn)和細(xì)菌學(xué)檢測具有同樣的敏感性和特異性。朱明東等〔8〕建立了診斷牛布魯氏菌病的GICA,通過對(duì)布魯氏菌病病牛和健康牛不同血清用量的測試,確定GICA診斷牛布魯氏菌病最佳血清用量為10μ L,檢測敏感性和特異性分別達(dá)到91.3%和 97.3%,Youden指數(shù)為0.886;GICA、斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)及SAT檢測結(jié)果比較三者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明,GICA診斷牛布魯氏菌病,不僅具有試劑敏感、特異,且血清用量少,操作簡便快速,適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場檢測。朱明東等〔9〕還采用 GICA、DIGFA和 SAT對(duì)不同流行區(qū)布魯氏菌病人群抗體平行檢測。結(jié)果重流行區(qū)、監(jiān)測地區(qū)和非疫區(qū)人群抗體陽性率,3種方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);GICA和SAT平行檢測布魯氏菌病重疫區(qū)人群抗體陽性符合率為94.2%。GICA和SAT平行檢測布魯氏菌病非疫區(qū)人群抗體陰性符合率為99.6%。GICA檢測不同疫區(qū)之間人群抗體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明GICA不僅能及時(shí)快速發(fā)現(xiàn)患者,而且可監(jiān)測疫情,反映流行程度,在布魯氏菌病不同流行區(qū)具有較好的推廣應(yīng)用前景。

2 分子生物學(xué)檢測——PCR及其衍生技術(shù)

PCR是布魯氏菌病分子生物學(xué)檢測和病原分型的重要手段,同時(shí)也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。早在1994年,Bricker等〔10〕根據(jù)布魯氏菌染色體中的遺傳成分IS711種特異性定位引起的多態(tài)現(xiàn)象就建立PCR檢測方法,并根據(jù)在距IS711不同距離的引物雜交擴(kuò)增產(chǎn)物大小來進(jìn)行種型鑒定,能將布魯氏菌牛種(1 、2、4 型)、羊種(1 、2、3 型)、豬種(1 型)、綿羊附睪種區(qū)分鑒別,并將該方法稱為AMOS(abortus,melitensis,ovis,suis)PCR。后來他們改進(jìn)了AMOS PCR,使之可以鑒別 S19和 RB51〔11〕。2003年Bricker等〔12〕在原有的基礎(chǔ)上又改進(jìn)了AMOS PCR,建立了 Bass(brucella abortus species-specific)PCR,能從布魯氏菌疫苗株、其他種布魯氏菌和非布魯氏菌中區(qū)別牛種布魯氏菌流行株(1、2、4型),是牛種布魯氏菌篩選的一種可信賴方法。Ocampo等〔13〕通過AMOS-ERY PCR 和以IS711為探針的Southern blot雜交發(fā)現(xiàn),牛3型除有牛3a外,還有牛3b生物型,進(jìn)而用IS711 AMOS作為引物擴(kuò)增出長1.7kb產(chǎn)物,可以鑒別出牛3b型、牛5、牛6和牛9型。Whatmore等〔14〕利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度多態(tài)性可以將布魯氏菌牛種、羊種、沙林鼠種、犬種、豬種、綿羊附睪種以及海洋種布魯氏菌區(qū)別開來。Fayazi等〔15〕用一個(gè)長度為 25bp的引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后豬種菌得到420bp產(chǎn)物,牛種菌得到420bp和650bp 2個(gè)條帶,從而將豬種和牛種布魯氏菌鑒別開。Cloeckaert等〔16〕應(yīng)用 PCR擴(kuò)增 bp26基因得到1 029 bp和1 900 bp,其中1 029 bp為布魯氏菌6個(gè)種共有的產(chǎn)物,1 900 bp為海洋種布魯氏菌所特有。2001年,Cloeckaert等〔17〕又發(fā)現(xiàn)利用omp2基因的多態(tài)性也可以將海洋種與其他布魯氏菌區(qū)分開。Redkar等〔18〕應(yīng)用 Real-Time PCR鑒別了布魯氏菌的牛、羊、豬 3個(gè)種。Probert等〔19〕也用RT-PCR技術(shù)鑒別牛種、羊種和其他種布魯氏菌。Hinic等〔20〕建立的即可常規(guī)操作又可 Real-Time PCR的PCR新方法,特異性強(qiáng),可鑒別6個(gè)種的布魯氏菌。Vladyslava等〔21〕應(yīng)用 PCR可以鑒別布魯氏菌的6個(gè)種,并能將豬4型單獨(dú)鑒別出來。López等〔22〕建立了一種多重PCR實(shí)驗(yàn)(階梯法),7個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)來自不同動(dòng)物和不同地區(qū)的625個(gè)布魯氏菌株的檢測表明,一步法可以鑒別古典布魯氏菌種,包括海洋種及疫苗株S19、RB51和Rev.1。

Garcia等〔23〕用 DdeⅠ消化omp31b基因擴(kuò)增產(chǎn)物做PCR-RFLP,通過對(duì)37株代表所有種和型的參考株和野毒株分析,可在種水平上鑒別牛種、羊種和綿羊附睪種布魯氏菌。Le等〔24〕應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析(MLVA)方法,使用MLVA-15可以對(duì)布魯氏菌屬21個(gè)菌株進(jìn)行分型,并認(rèn)為MLVA-15可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)分型方法進(jìn)行種、型鑒定。Whatmore等〔25〕依據(jù)21個(gè)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)基因座(包括8個(gè)已報(bào)告的和13個(gè)以前未報(bào)告的)建立的分子亞類鑒定方法——VNT R方法,通過對(duì)來自世界各地的121株布魯氏菌進(jìn)行檢測證明,VNTR是一種好的分型方法,并可用于流行病學(xué)追蹤和菌株親緣關(guān)系確定。王遠(yuǎn)志等〔26〕利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(shù)(HOOF-Prints)對(duì)綿羊種布魯氏菌019株VNTR的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,可鑒定該菌株,并有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法之不足。

Ohtsuki等〔27〕根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌 BCSP31株的基因序列設(shè)計(jì)兩組用于6個(gè)種布魯氏菌鑒別的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的特異性引物,通過對(duì)6個(gè)種22株布魯氏菌和18個(gè)種28株非布魯氏菌的檢測表明,對(duì)布魯氏菌的檢測具有特異性(35min,63℃)和敏感性(10fg基因組DNA)。另外該方法還可用于污染牛奶和感染鼠器官中菌體DNA的檢測。Montagnaro等〔28〕應(yīng)用牛種布魯氏菌 O-LPS與FITC結(jié)合作示蹤劑建立了熒光偏振試驗(yàn)(FPA),通過對(duì)890份水牛血清(CFT檢測,526份為陽性,364份為陰性)進(jìn)行RBT和FPA的平行檢測,與CFT相比,敏感性分別為84.5%和92.6%,特異性分別為93.1%和 91.2%,檢測結(jié)果表明,FPA與CFT檢測效果相當(dāng)可以替代RBT,并且具有可靠、高通量、易操作,適于野外血清抗體調(diào)查。

3 結(jié) 語

目前傳統(tǒng)的檢測方法,如 SAT、PAT、RBT、MRT、Coomb's、CFT等仍然是國際貿(mào)易和許多發(fā)展中國家進(jìn)行布魯氏菌病檢疫、監(jiān)測的重要方法。間接 ELISA、CELISA、IgG ELISA和 IgM ELISA等方法敏感、特異,可用于血清抗體效價(jià)的檢測,野毒株的分型、自然感染與疫苗免疫的鑒別,并可用于大樣本檢測。免疫組化在組織中檢查病原及分布有其優(yōu)點(diǎn)。GICA雖然不如CFT和ELISA敏感、特異,但操作方便,結(jié)果易于判斷,適合臨床調(diào)查和疫病普查。以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)不僅用于布魯氏菌種的鑒定,還因其能反映基因間存在的差異,因此可在基因水平上進(jìn)行分型和疫苗株鑒定。未來的方向是研制簡單、特異、敏感,適合于野外和實(shí)驗(yàn)室大樣本操作的血清抗體監(jiān)測、病原檢測及核酸檢測方法。并以此為基礎(chǔ),在布魯氏菌病較為嚴(yán)重的國家建立綜合防控體系,加強(qiáng)動(dòng)物布魯氏菌病檢疫監(jiān)督和凈化,從源頭上控制人的布魯氏菌病。

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R516.7

A

1002-2694(2010)01-0081-03

*內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校研究項(xiàng)目(NJzy08165)

呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,呼倫貝爾 021008

2008-12-12;

2009-03-25