副豬嗜血桿菌的分離鑒定與自家苗的制備

○河南科技學(xué)院 董永軍 王麗榮 王憲文 王同燕 曲書哲 杭柏林 姚四新

隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病。該病可以影響從2周齡～4月齡的豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病。通常見于5～8周齡的小豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴重時死亡率可達50%。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂。主要剖檢病變表現(xiàn)為纖維性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。因此，分離副豬嗜血桿菌地方菌株，研制地方流行血清型的自家苗，對該病的預(yù)防、控制有重大意義。

筆者實習(xí)所在的預(yù)防獸醫(yī)實驗室從新鄉(xiāng)5個患嚴重疑似多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎病的豬場中，分離鑒定出副豬嗜血桿菌。選取分離鑒定出的10株副豬嗜血桿菌研究自家苗的制備方法。通過與患有該病的豬場合作，將所研制的疫苗對新引進的健康豬進行常規(guī)的免疫。通過疫苗對這些豬場新引進的健康豬保護力觀察來驗證該疫苗。因制苗菌株是從這些豬場分離的，抗原針對性強，對患有此病的豬場副豬嗜血桿菌病的預(yù)防、控制，起到很好的作用。

一、材料與方法

1.供試材料。

（1）病料。從新鄉(xiāng)5個患有嚴重疑似多發(fā)性漿膜炎和纖維性關(guān)節(jié)炎病的豬場采集病料15份，病豬表現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂。剖檢病變表現(xiàn)為胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。分別采取不同部位的病料，即呼吸道分泌物、血液、胸膜、心包膜或腹膜腔內(nèi)的滲出物。

（2）試劑。葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脲酶等生化微量鑒定管；營養(yǎng)瓊脂，硫柳汞，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），甲醛，金黃色葡萄球菌，吐溫-80和司本-80，10號白油，硬脂酸鋁，小白鼠。

（3）培養(yǎng)基。兔鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板按常規(guī)方法制備。

2.試驗方法。

（1）病原菌分離。在無菌操作條件下，將15份病料分別在巧克力瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h后，挑取疑似副豬嗜血桿菌單個菌落，再進行純培養(yǎng)。

（2）涂片鏡檢。挑取上述純培養(yǎng)疑似副豬嗜血桿菌單個菌落，分別涂片、革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及染色結(jié)果。

（3）生化鑒定。V因子需要試驗：在無菌條件下，分別挑取上述15份病料可疑菌落，水平劃線于無NAD的兔鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，置于CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察細菌的生長情況，即看是否有衛(wèi)星生長現(xiàn)象，同時觀察是否有溶血現(xiàn)象。

（4）生化試驗。取具有衛(wèi)星生長現(xiàn)象且不溶血的單個菌落純培養(yǎng)后分別接種于添加NAD的含有葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脲酶等的生化微量鑒定管中，置于CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察生化反應(yīng)和糖發(fā)酵活性結(jié)果，同時進行氧化酶試驗和接觸酶試驗。

3.疫苗研制。用本實驗分離鑒定出的副豬嗜血桿菌來研究油乳劑滅活苗制備方法，制備副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗。

（1）制苗菌株。選取從嚴重患病豬場分離并鑒定為副豬嗜血桿菌的菌株作為制苗菌株。

（2） 菌液的制備。將制苗菌株分別接種于巧克力瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24h，制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度約為30億個/mL，加入甲醛，37℃滅活48h。然后用滅活菌液接種巧克力瓊脂平板上24 h，無菌生長時可備用制苗。

（3）油相的制備。副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗的油相為10號白油占94%(V／V)，司本-80占6%(V／V)。先將10號白油緩慢加溫，至56℃左右時加入司本-80，邊加熱邊攪拌，混勻后再加入總體積2%的硬脂酸鋁，充分攪拌使其完全溶解，直至透明，避免出現(xiàn)黏性膠凍樣物。然后，過濾，分裝，高壓滅菌30min，即為油相，冷卻后備用。

（4）水相制備。取滅活菌液和吐溫-80，按適當比例充分混勻后，即為水相，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

（5） 乳化和分裝。取油相3份置勻漿機內(nèi)，慢速攪拌，同時徐徐加入水相1份，然后加速攪拌，加完后再以10000r/min攪拌3min，使水油充分乳化，制成油包水型油乳劑。在終止攪拌前加入硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。然后，定量分裝，加蓋密封。

4.疫苗物理性狀的檢驗。

（1）黏度測定。用1mL口徑為1.2mm的吸管，在室溫下吸滿1mL乳劑，以吸管垂直狀態(tài)時放出0.4 mL疫苗所需要的時間作為判定標準，在2～6s內(nèi)流出，則為稀薄乳劑，超過6s以后流出，則為較稠乳劑，稀薄乳劑為合格。

（2）穩(wěn)定性測定。取副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗1.5mL加入離心管，以3000r/min離心15min，以不分層為穩(wěn)定性良好。

（3）劑型檢查。取潔凈的吸管，吸取少量油乳劑滅活苗分別滴入加水和加白油的平皿中，然后用牙簽攪拌，如果不溶于水而溶于白油，則可判定為油包水型，否則判為水包油型。

5.疫苗質(zhì)量檢驗。

（1）疫苗無菌檢驗。將油乳劑滅活苗取0.1mL接種于巧克力瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48h檢查細菌生長情況。

（2）生物安全試驗。取6只體重為10～20g的小白鼠（雌雄各半），皮下注射油苗0.5mL/只，連續(xù)觀察7d，查看反應(yīng)情況。

（3）效果檢查。通過與患有嚴重該病的豬場合作，將所制的副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗對新引進的160頭健康豬進行常規(guī)的免疫，連續(xù)觀察60d看是否有發(fā)病情況。

二、結(jié)果與分析

1.細菌分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察結(jié)果。將純化好的細菌分別接種于巧克力瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48h后，觀察到普通營養(yǎng)瓊脂平板上沒有生長菌落；巧克力瓊脂平板上生長出邊緣整齊、小而透明的菌落。

取上述菌落抹片、革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，有大小不等，短小桿狀、球桿狀、絲狀等多種不同的形態(tài)細菌，革蘭氏染色為陰性。

通過細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察，初步判定該細菌為副豬嗜血桿菌，要確診需進一步進行生化試驗。

2.分離菌株生化試驗結(jié)果。V因子需要試驗：可見10株分離細菌在金黃色葡萄球菌周圍生長出灰白色、半透明、圓形、邊緣整齊的小菌落，而越遠離者則菌落越小，甚至不生長，表明10株有衛(wèi)星現(xiàn)象，均為NAD生長依賴菌；其他5株不具有衛(wèi)星現(xiàn)象。而且此15株細菌都不溶血。

根據(jù)衛(wèi)星生長現(xiàn)象，結(jié)合生化實驗結(jié)果可以看出，分離的10株符合副豬嗜血桿菌特性，確診為副豬嗜血桿菌。其余5株不是副豬嗜血桿菌。

3.疫苗研制結(jié)果。

（1）黏度檢查結(jié)果。在室溫下吸滿1mL油苗，以吸管垂直狀態(tài)時放出0.4mL疫苗所需要的時間為5s，不超過6s為稀薄乳劑，黏度為合格，適合注射用。

（2）劑型檢查結(jié)果。所制疫苗易溶于白油而呈均勻分散狀態(tài)，在水中呈油滴狀，不散開，為油包水油乳劑。

（3）穩(wěn)定性檢查結(jié)果。所制疫苗于離心管中3000r/min離心15 min，未出現(xiàn)分層和破乳現(xiàn)象，說明試制疫苗合格。

（4）無菌檢驗結(jié)果。將油乳劑滅活苗接種于巧克力瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48h，無菌生長。

（5）生物安全試驗。6只小白鼠皮下注射油乳劑滅活苗連續(xù)觀察7d，精神和食欲未見異常。

（6）效果檢查結(jié)果。通過和新鄉(xiāng)患有嚴重副豬嗜血桿菌病的豬場合作，將所制的副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗對新引進的160頭健康豬進行常規(guī)免疫，連續(xù)觀察60d，其保護率達到96.9%。

通過細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察以及生化試驗，可確診所分離的10株細菌為副豬嗜血桿菌，對所制得的疫苗進行質(zhì)量檢驗和安全性檢驗，均符合要求，效果檢查結(jié)果也表明起到了很好的保護效果，證明本實驗是成功的。

三、小結(jié)

副豬嗜血桿菌是上呼吸道中一種常在菌，故確診是否由副豬嗜血桿菌感染引起的病例，必須從漿膜、心包、腹膜、關(guān)節(jié)和腦膜等全身各部位采樣、送檢才能進行本菌感染診斷，而且進行病原分離時，要選擇具有代表性的樣品才能作出正確診斷。本實驗從新鄉(xiāng)5個患嚴重多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎病的豬場中采集病料15份，結(jié)合臨床癥狀和剖檢病變的觀察，通過在巧克力培養(yǎng)基上分離細菌并進行培養(yǎng)，然后涂片鏡檢，進行生化實驗等一系列的實驗室檢查，分離鑒定出10株副豬嗜血桿菌。用分離鑒定的10株副豬嗜血桿菌，制備了副豬嗜血桿菌的油乳劑滅活苗。

通過和新鄉(xiāng)幾個患有嚴重該病的豬場合作，將所制得的自家苗對新引進的160頭健康豬進行常規(guī)免疫，結(jié)果表明，自家苗對這些豬場該病的防治取得了很好效果。