蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

黃利勇 綜述 蔡三軍 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象的一門嶄新的生命科學(xué)，正逐漸成為后基因組時代的研究熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，已越來越廣泛地被應(yīng)用于人類惡性腫瘤的研究領(lǐng)域。結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，本文總結(jié)了近年來蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，很大程度上是建立在質(zhì)譜技術(shù)不斷改進(jìn)的基礎(chǔ)之上。此外，不斷完善的生物信息學(xué)也為繁雜的數(shù)據(jù)分析提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

1.1 蛋白質(zhì)樣品的制備技術(shù) 樣品的制備在任何一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究中都是至關(guān)重要的一步，可直接影響實驗結(jié)果的重復(fù)性［1］。目前已普遍應(yīng)用的鈣沉積和免疫磁性分離技術(shù)都是獲取高純度樣本的方法。激光捕獲微切割技術(shù)（laser capture microdissection，LCM）的出現(xiàn)可使研究者從復(fù)雜的組織樣本中獲得均一的腫瘤細(xì)胞，從而避免了其他混雜細(xì)胞的影響，保證了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2 雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE） 雖然雙向凝膠電泳的出現(xiàn)迄今已有約30年的時間，但其仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中一項廣泛應(yīng)用的技術(shù)。其基本原理是根據(jù)等電點和分子量的不同將復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺膠上分離。隨著其技術(shù)的不斷完善，雙向凝膠電泳的分辨率、敏感度及可重復(fù)性都得到了明顯的提高，但其仍存在明顯不足之處：不能有效地分離出極酸和極堿性蛋白；低豐度蛋白不易檢出。此外，2-DE工作量大，操作費時、費力。

1.3 差異凝膠電泳（two-dimensional difference gel electrophoresis 2D-DIGE） 此技術(shù)是在雙向凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一項新技術(shù)。其特點是可將3種待比較的蛋白樣品用不同的熒光染料分別標(biāo)記后在同一塊凝膠上行雙向電泳，通過激發(fā)不同熒光染料所得到的熒光強(qiáng)度從而達(dá)到蛋白質(zhì)差異比較的目的。由于是在同一塊膠上同時進(jìn)行3種樣品分析，減少了跑膠次數(shù)及不同膠上蛋白點陣的變異，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確［2］，即節(jié)約時間，又提高了可重復(fù)性，大有取代傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳趨勢。其缺點是分析的通量低。

1.4 多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（multidimensional protein identification technology，MudPIT） 此技術(shù)是近幾年逐漸得到應(yīng)用的一項具有高度靈敏性的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)［3-4］。基本原理為樣品首先經(jīng)特異性蛋白酶消化：第一向通過等電聚焦對不同等電點的蛋白質(zhì)分離；第二向根據(jù)疏水性的不同再次分離蛋白質(zhì)；第三向利用電噴霧離子化飛行時間質(zhì)譜測量蛋白質(zhì)的相對分子量并對其進(jìn)行定量。此項技術(shù)靈敏度高，適用于高分子量及低分子量蛋白質(zhì)的分離，并且實現(xiàn)了儀器的自動化操作，較傳統(tǒng)的電泳技術(shù)具有明顯優(yōu)勢，正受到越來越多的學(xué)者的青睞。但其也存在分析的通量低、耗時等不足。

1.5 表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOFMS） SELDI-TOF-MS是近幾年興起的一項具有應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，由蛋白質(zhì)芯片、飛行時間質(zhì)譜和相應(yīng)分析軟件3部分組成?；驹硎腔诘鞍踪|(zhì)芯片的特異性吸附作用，加上能量吸收劑后經(jīng)激光脈沖輻射使被結(jié)合的蛋白質(zhì)解析形成離子，根據(jù)質(zhì)荷比不同的離子在真空場中飛行的時間長短不一而繪制成質(zhì)譜圖，最后經(jīng)軟件分析便可得到蛋白質(zhì)相關(guān)信息。SELDI-TOF-MS具有操作簡便、通量高、樣本用量少，可直接對體液如血清、尿液和組織液等進(jìn)行檢測，目前已在不同腫瘤早期診斷的研究中得到了很好的應(yīng)用［5,8-10］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用 迄今為止，已有很多研究小組報道了應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究結(jié)直腸癌所取得的成果，這些成果主要集中在發(fā)掘新的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物方面。

2.1 結(jié)直腸癌的診斷與鑒別診斷 Stulik等［6］較早的利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜的方法對結(jié)直腸癌組織及鄰近的正常粘膜組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究。研究發(fā)現(xiàn)與正常黏膜組織相比，HSP70、 S100A9、 S100A8、S100A11和S100A6在癌組織中表達(dá)量顯著增加，而肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白、肌動結(jié)合蛋白和環(huán)氧合酶2表達(dá)顯著下降。Alfonso等［7］采用2D-DIGE的方法比較了7例結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了41種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，可作為潛在的結(jié)直腸癌早期診斷生物標(biāo)志物。這些蛋白主要涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1、滑液肉瘤X5蛋白），細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白Ⅳ和Ⅴ及松弛素），細(xì)胞改造和細(xì)胞骨架（細(xì)胞角蛋白、波形蛋白和β-肌動蛋白）的形成，蛋白質(zhì)合成和折疊（熱休克蛋白、組織蛋白酶和鈣網(wǎng)織蛋白）。

Engwegen等［8］用SELDI-TOF-MS技術(shù)對2組獨立的血清標(biāo)本（A組為40例結(jié)直腸癌患者血清、49例健康人血清，B組為37例結(jié)直腸癌患者血清、31例健康人血清）分別進(jìn)行研究，得到由蛋白質(zhì)荷比為3 100、3 300、4 500、6 600和28 000構(gòu)成的分類樹，其診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度在65%~90%之間。研究者還發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)特異的蛋白質(zhì)有別于其他類型腫瘤，亦可作為結(jié)直腸癌的鑒別診斷之用。最近，2項獨立的研究［9-10］幾乎同時報道了人類中性粒細(xì)胞肽（HNP）1、2、3（或稱之為α防御素1、2、3），相對于正常對照樣本，其不僅在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量增高，而且在結(jié)直腸癌患者血清中同樣也是增高的。這也表明了癌組織與血清的蛋白表達(dá)之間有一定的關(guān)聯(lián)性。對于同時在組織和血清中表達(dá)都顯著增高的人類中性粒細(xì)胞肽，其作為結(jié)直腸癌生物診斷的標(biāo)志物應(yīng)該具有很大的臨床意義；然而，在某些情況下（如感染時），其在血清中的表達(dá)也會增加，同時，血清學(xué)中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究遠(yuǎn)比組織中要復(fù)雜［11］。故HNP 1、2、3作為結(jié)直腸癌早期診斷的血清生物標(biāo)志物的應(yīng)用價值受到質(zhì)疑，有待進(jìn)一步研究。

最近，Roblick等［12］報道了1例將蛋白質(zhì)組學(xué)實際應(yīng)用于臨床鑒別診斷中的實例：對于1例侵及左側(cè)卵巢及乙狀結(jié)腸的盆腔低分化腺癌，利用常規(guī)病理檢查及免疫組織化學(xué)方法都不能明確辨別其是來源于卵巢還是腸道。作者用8例結(jié)腸癌和7例卵巢腺癌組織樣本進(jìn)行2-DE分離蛋白后作為對照，與此例盆腔腫瘤組織的2-DE圖像比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此病例有超過89%蛋白點與結(jié)腸癌匹配，而僅有63%的點與卵巢癌匹配，進(jìn)一步行主成分分析后發(fā)現(xiàn)其蛋白集聚性與結(jié)腸癌完全一致，而與卵巢癌則不完全相同，從而確定了此例腫瘤源于結(jié)腸，由此患者在手術(shù)后接受了正確的輔助治療。此研究提示組織2-DE蛋白表達(dá)譜像結(jié)合主成分分析在鑒別低分化腺癌來源方面具有臨床應(yīng)用前景。

2.2 結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的研究 Pei等［13］對與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了研究。研究組以術(shù)后病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各5例患者的癌組織為研究對象，經(jīng)2-DE分離蛋白后結(jié)合質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-27、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、膜聯(lián)蛋白Ⅱ在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)明顯增高，而肝脂肪酸結(jié)合蛋白則明顯下調(diào)，此結(jié)果在組織芯片免疫組織化學(xué)檢測中得到證實，提示上述蛋白質(zhì)表達(dá)差異可能與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Kang等［14］則對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移作了相應(yīng)研究。作者以14例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本按是否存在肝轉(zhuǎn)移分成2組各7例，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT細(xì)胞通路上的3個重要蛋白（磷酸化IκBα、腫瘤壞死因子-α和微原纖維相關(guān)蛋白-3）表達(dá)在2組間存在顯著差異。隨后作者以這3個蛋白的表達(dá)差異為一整體，在含有105例獨立樣本的結(jié)直腸癌組織中進(jìn)行結(jié)果驗證，其在判斷肝轉(zhuǎn)移的敏感度達(dá)(92.85±4.87)%，特異度達(dá)(94.94±2.5)%。這表明以上3個蛋白在癌組織中的整體表達(dá)差異可作為判斷原發(fā)結(jié)直腸癌是否存在肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

2.3 判斷結(jié)直腸癌預(yù)后 Kim等［15］在對14例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁正常黏膜組織進(jìn)行2-DE比較后發(fā)現(xiàn)有14個點的蛋白質(zhì)表達(dá)存在明顯差異，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)硒結(jié)合蛋白1（SELENBP1）在14例癌組織的12例中表達(dá)明顯下調(diào)。隨后作者進(jìn)一步在包含240例的結(jié)直腸癌組織芯片中對其檢測，發(fā)現(xiàn)癌組織中SELENBP1表達(dá)明顯下降的病例其5年生存率明顯低于SELENBP1表達(dá)高的病例，由此得出SELENBP1的低表達(dá)是結(jié)直腸黏膜癌變過程中的常見且提示預(yù)后不良的事件，其與結(jié)直腸癌病情的快速進(jìn)展有關(guān)。

最近國內(nèi)有學(xué)者［16］用相同的方法在對10例結(jié)直腸癌患者的癌組織及癌旁組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)并驗證了索蛋白（Desmin）在癌組織中顯著高表達(dá)。研究者進(jìn)一步進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測后發(fā)現(xiàn)Desmin在癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理分期及腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，分期越晚、腫瘤細(xì)胞分化程度越低則Desmin表達(dá)水平越高，同時生存分析顯示Desmin高表達(dá)的患者其5年生存率顯著降低。此項研究結(jié)果提示Desmin是具有判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后意義的分子標(biāo)志物。

2.4 指導(dǎo)結(jié)直腸癌的個體化治療 Allal等［17］以局部進(jìn)展期直腸癌患者為研究對象，術(shù)前新輔助放療后根據(jù)療效評價分成2組，進(jìn)行蛋白表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)了與放療不敏感的相關(guān)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物：熱休克蛋白、β-微管蛋白、鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ和原肌球調(diào)節(jié)蛋白；與放療敏感的相關(guān)標(biāo)志物：Ⅰ型角蛋白、切跡2蛋白同系物和DNA修復(fù)蛋白RAD51L3?；谏鲜鼋Y(jié)果，研究者有望制造出可以對局部進(jìn)展期直腸癌患者進(jìn)行術(shù)前放療敏感性篩查的生物芯片，這將有助于直腸癌患者的個體化治療。

Tanaka等［18］對化療藥物5-FU敏感的結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1和對5-FU耐藥的DLD-1/5-FU細(xì)胞株之間進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)DLD-1/5-FU細(xì)胞株中有5種蛋白（核內(nèi)核糖核蛋白G、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A、組蛋白H2B、組蛋白H4和核糖體蛋白L3）表達(dá)較DLD-1細(xì)胞株顯著增高，提示這5種蛋白與腫瘤細(xì)胞對化療藥物5-FU的耐藥有關(guān)，這將在臨床醫(yī)師制定個體化的化療方案方面具有潛在的指導(dǎo)意義。

3 問題與展望 蛋白質(zhì)組學(xué)研究為研究者們提供了很好的蛋白質(zhì)分離與分析手段。但是，蛋白質(zhì)組學(xué)仍存在技術(shù)上的瓶頸，如低豐度蛋白質(zhì)的分辨、有效的分子量檢測范圍等方面的限制。伴隨著近幾年蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)以及具有更高靈敏度與特異度的新技術(shù)的涌現(xiàn)，技術(shù)上的限制正逐步得到解決，這將會為發(fā)掘蛋白質(zhì)標(biāo)志物的研究敞開大門［19］。

蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及檢測方面具有不可替代的優(yōu)勢。其應(yīng)用于結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物方面的研究，最終目的是有助于結(jié)直腸癌患者的診斷與鑒別診斷、轉(zhuǎn)移的研究、判斷預(yù)后以及個體化治療等方面提供依據(jù)［20］。雖然它在結(jié)直腸癌中的研究還處于起步階段，但是已經(jīng)取得了可喜的科學(xué)成果，目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定出了很多有意義的生物標(biāo)志物，并且很多研究成果已經(jīng)開始應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床工作中，使結(jié)直腸癌醫(yī)學(xué)分子水平的研究進(jìn)入到了嶄新階段。隨著越來越多的研究成果的報道，我們有理由相信其臨床應(yīng)用前景必將更加廣闊。

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