表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的小鼠骨肉瘤體外和體內(nèi)荷瘤模型的建立

楊曉 胡豇

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072

小鼠骨肉瘤細(xì)胞株S180是國內(nèi)外使用較多的一種腫瘤細(xì)胞株，可在清潔級小鼠或裸鼠的皮下和腹水成瘤，而在體外培養(yǎng)均為半貼壁細(xì)胞［1］。本研究采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）導(dǎo)入S180細(xì)胞，同時(shí)在體內(nèi)外對標(biāo)記的S180（EGFP-S180）細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要材料 質(zhì)粒表達(dá)載體（pEGFP-N1）購自Clontech公司，宿主菌（DH5а）由本實(shí)驗(yàn)室保種，質(zhì)粒提取純化試劑盒購自天為時(shí)代試劑公司。RPMI1640培養(yǎng)液干粉以及胎牛血清（FBS）為美國Gibco BRL公司產(chǎn)品。G418和牛血清白蛋白（BSA）均購自美國Sigma公司，鼠抗鼠單克隆抗體（一抗），熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗小鼠IgG（二抗）和Sp900免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)公司。健康成年清潔級NIH小鼠，6～8周齡，25～30 g，雌雄不限，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。

1.2 質(zhì)粒擴(kuò)增及純化 取菌種大腸埃希菌DH5а 30 mL轉(zhuǎn)接種于3 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，采用CaCl2（0.1 mmol/L）制備感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，12～16 h后則可見菌落產(chǎn)生，挑取轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接種于含2 mL 200 mg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜（搖床速度200 r/min），抽提細(xì)菌質(zhì)粒并保存?zhèn)溆?。? mL用紫外分光光度計(jì)測其濃度及純度，1.5%瓊脂糖電泳檢測質(zhì)粒構(gòu)型是否與原質(zhì)粒一致。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及FCM測定轉(zhuǎn)染率 S180細(xì)胞系用含10% FBS、105U/L的青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 mmol/L HEPES及2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，常規(guī)傳代，將1×108個(gè)細(xì)胞制備成1 mL的細(xì)胞懸液，加入質(zhì)粒載體（2 mg）充分混勻后室溫置放15 min，然后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)瓶，用細(xì)胞電融合儀（Electro Square Porator ECM 830，BTX）電轉(zhuǎn)染（電壓750 V，脈寬200 ms），之后補(bǔ)充適量新鮮培養(yǎng)液置入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后觀察轉(zhuǎn)染陽性率，并洗滌、離心（800×g）和換液，同時(shí)取細(xì)胞制備成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀（FACSCALIBAR Becton Dickin Son Cormpony，488 nm激發(fā)光波長，510發(fā)射光波長）測定轉(zhuǎn)染率。

1.4 篩選穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株及細(xì)胞形態(tài)觀察低速離心（800 r/min×3 min）收獲上述被轉(zhuǎn)染EGFP陽性細(xì)胞，加入G418（800 mg/mL）的選擇性培養(yǎng)液進(jìn)行選擇培養(yǎng)2周，得到EGFPS180陽性細(xì)胞克隆，倒置熒光顯微鏡下挑取發(fā)強(qiáng)熒光的細(xì)胞克隆后于96孔板進(jìn)行克隆，用含G418（200 mg/mL）的選擇性培養(yǎng)液維持培養(yǎng)4周，得到接近100%的EGFP-S180的細(xì)胞株，持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。

1.5 EGFP-S180和S180細(xì)胞中c-Myc的表達(dá) 采用離心涂片（1 000 ×g離心3 min）的方法分別將EGFP-S180和S180細(xì)胞制備成細(xì)胞涂片，95%乙醇固定細(xì)胞，按SP-900操作方法加入c-Myc（1∶100），4 ℃反應(yīng)過夜，加入Cy3熒光標(biāo)記的二抗（用1% BSA 1∶60稀釋），室溫溫育1 h，在激光共聚焦顯微鏡下及時(shí)觀察，在不同的視野中選取100個(gè)腫瘤細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡自帶軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的分析。

1.6 EGFP-S180和S180皮下和腹腔移植荷瘤時(shí)間與生存時(shí)間的觀察 將EGFP-S180和S180細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液充分洗滌后制備成1×108/mL的細(xì)胞懸液，分別取0.1 mL接種至KM小鼠右前腋皮下和腹腔，觀察皮下荷瘤時(shí)間及腹腔成瘤時(shí)間和小鼠的生存時(shí)間，隨后將癌性腹水涂片及瘤組織切片后進(jìn)行熒光觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 對計(jì)量資料行方差分析，對計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株的克隆 攜帶有neomycin抗性基因的質(zhì)粒載體經(jīng)擴(kuò)增和純化后可以有效地轉(zhuǎn)染小鼠S180細(xì)胞株，采用細(xì)胞流式法（flow cytometry，F(xiàn)CM）測定48 h時(shí)的轉(zhuǎn)染率為57.3%，用G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的EGFP-S180細(xì)胞，發(fā)出亮綠色的GFP熒光（圖1）。

2.2 EGFP-S180和S180細(xì)胞中c-Myc的表達(dá) 在激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-S180和S180細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)（呈紅色熒光），其熒光強(qiáng)度分別為55.04±0.21和52.17±0.23，其表達(dá)無顯著性差異（P>0.05），EGFP-S180細(xì)胞自發(fā)綠色熒光與c-Myc紅色熒光表達(dá)合成如圖2所示。

圖2 EGFP-S180細(xì)胞體外自發(fā)綠色熒光與c-Myc紅色熒光表達(dá)合成圖Fig.2 The combination of the EGFP-S180 cells and c-Myc with Cy3 staining in vitro

2.3 EGFP-S180和S180皮下和腹腔移植荷瘤時(shí)間與生存時(shí)間的觀察 EGFP-S180細(xì)胞能在小鼠皮下和腹腔中形成腫瘤，并且EGFP-S180細(xì)胞和S180細(xì)胞在皮下的成瘤時(shí)間和在腹腔中成瘤的時(shí)間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與S180細(xì)胞組小鼠比較，EGFP-S180細(xì)胞組腹腔荷瘤小鼠的的生存時(shí)間沒有明顯改變（P>0.05，表1、2）。實(shí)體瘤組織切片與癌性腹水涂片的檢測結(jié)果均顯示有亮綠色熒光表達(dá)（圖3、4）。

表1 EGFP-S180和S180皮下荷瘤時(shí)間Tab.1 Time of cancer-bearing subcutaneous model of EGFP-S180 and S180 cells(n=25, )

表1 EGFP-S180和S180皮下荷瘤時(shí)間Tab.1 Time of cancer-bearing subcutaneous model of EGFP-S180 and S180 cells(n=25, )

表2 EGFP-S180和S180腹腔荷瘤時(shí)間及其生存時(shí)間Tab.2 Time of cancer-bearing and survival time abdominal cavity model of EGFP-S180 and S180 cells(n=25, )

表2 EGFP-S180和S180腹腔荷瘤時(shí)間及其生存時(shí)間Tab.2 Time of cancer-bearing and survival time abdominal cavity model of EGFP-S180 and S180 cells(n=25, )

圖3 EGFP-S180皮下瘤組織冰凍切片F(xiàn)ig.3 Subcutaneous tumor of EGFP-S180 cells(×200)

圖4 EGFP-S180腹水瘤涂片F(xiàn)ig.4 Carcinomatous ascites of EGFP-S180 cells(×100)

3 討 論

小鼠骨肉瘤S180是國內(nèi)外使用較多的腫瘤細(xì)胞株，可在清潔級小鼠或裸鼠的皮下和腹腔接種成瘤，在體外培養(yǎng)為半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。c-Myc基因是Myc基因家族的重要成員之一，c-Myc基因既是一種可易位基因，又是一種多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)節(jié)基因，同時(shí)也是一種可使細(xì)胞無限增殖，獲永生化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-Myc在S180 細(xì)胞的表達(dá)常常被認(rèn)為是鑒定其腫瘤特征及細(xì)胞株穩(wěn)定性的指標(biāo)之一［2］。本實(shí)驗(yàn)通過激光共聚焦顯微鏡檢測了轉(zhuǎn)染前后S180 細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)c-Myc的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后其表達(dá)量無顯著變化，表明了S180 細(xì)胞的增殖生物學(xué)行為及c-Myc基因表達(dá)沒有因?yàn)镋GFP導(dǎo)入細(xì)胞而改變，在細(xì)胞和分子水平上證實(shí)了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞無明顯的生物學(xué)行為改變。

EGFP作為一種生物源性的熒光標(biāo)記，在GFP的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，具有高效、穩(wěn)定、無毒、易于檢測等特性，已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器的標(biāo)記和特定基因表達(dá)的研究，尤其是EGFP也不影響活細(xì)胞正常功能，可以直接在活細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行分析［3］。目前，由于熒光成像技術(shù)的發(fā)展，將這種標(biāo)記用于活體實(shí)驗(yàn)的研究，尤其在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成方面開始逐漸增多［4］。建立長期、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株是進(jìn)行熒光標(biāo)記細(xì)胞研究的基本前提。普通熒光顯微鏡就可觀察到EGFP熒光；同時(shí)，熒光成像技術(shù)發(fā)展極為迅速，活體熒光成像系統(tǒng)（whole body GFP imaging system）也開始應(yīng)用，它采用數(shù)字化超高靈敏度的CCD與軟件進(jìn)行定量分析，能夠在動(dòng)物活體上方便地實(shí)現(xiàn)對發(fā)光組織的特異性、敏感度的實(shí)時(shí)性觀測［5］。

本實(shí)驗(yàn)利用電轉(zhuǎn)染法，將編碼EGFP的真核表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞小鼠骨肉瘤S180中，建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株系，通過直觀的小鼠成瘤時(shí)間及腹腔荷瘤鼠的生存時(shí)間與蛋白水平檢測c-Myc的表達(dá)，表明EGFP-S180細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為并無改變，體內(nèi)的皮下和腹腔成瘤能力均未發(fā)生改變。因此，期望利用新近的熒光成像技術(shù)和高靈敏度的CCD對EGFP標(biāo)記的S180腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲提供體內(nèi)、外的一種簡單、方便的實(shí)驗(yàn)手段。但是，在將成功轉(zhuǎn)染的EGFP-S180細(xì)胞進(jìn)行小鼠腹腔傳代后需定期進(jìn)行該細(xì)胞株的生物學(xué)行為檢測，如生長曲線，癌基因表達(dá)等，以保證腫瘤細(xì)胞的生物行為與原始細(xì)胞株接近，能更好地反映細(xì)胞的生物學(xué)行為及用于相應(yīng)的研究。

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