溶酶體自噬途徑降解α－synuclein蛋白作用研究

王潤(rùn)青 趙 杰△ 張曉曼 劉 威 趙松耀 秦曉明 趙美英 孟宏音

1）鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450007 2）鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是當(dāng)今最為廣泛的神經(jīng)退行性疾病之一，在全世界40歲以上人口中，有超過(guò)0.1%的人受到該疾病影響。20世紀(jì)60～80年代，生物學(xué)研究主要集中在核酸及蛋白質(zhì)的翻譯上，蛋白質(zhì)的降解則被人們忽視，誤認(rèn)為是一個(gè)非特異的終端過(guò)程。近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白降解途徑的深入研究發(fā)現(xiàn)蛋白降解是一個(gè)復(fù)雜、縝密的調(diào)控過(guò)程，是細(xì)胞調(diào)控的重要機(jī)制。α－synuclein蛋白降解也不例外，眾多研究表明蛋白酶體抑制劑可誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)α－synuclein蛋白聚集包涵體形成，證明蛋白酶體通路影響α－synuclein蛋白降解，但作為細(xì)胞內(nèi)另外一條蛋白降解途徑——溶酶體途徑對(duì)α－synuclein蛋白降解的影響研究比較匱乏。本研究通過(guò)觀察溶酶體抑制劑E64對(duì)α－synuclein蛋白聚集、降解的影響，以揭示α－synuclein蛋白可通過(guò)溶酶體途徑降解，為明確PD發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（PC12細(xì)胞）由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基、小牛血清、馬血清購(gòu)自Gilbco公司，鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）購(gòu)自廈門(mén)北大之路生物工程有限公司，E64、硫磺素S、二甲基亞砜（DMSO）、魚(yú)藤酮（Rotenone）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗體和兔抗大鼠LAMP2抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，TRITC和FITC標(biāo)記熒光二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物試劑有限公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活小牛血清及5%的馬血清、青霉素100 U／mL、鏈霉素100U／mL，于5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液。藥物處理前1周用NGF（終濃度為50ng／mL）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元樣分化，處理當(dāng)天將Rotenone配制成1mmol／L的母液，E64配成10mmol／L的 母 液，Rotenone、E64 終 濃 度 分 別 為 100nmol／L、200 mmol／L，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)α－synuclein蛋白和硫磺素陽(yáng)性包涵體：本實(shí)驗(yàn)分組如下：①正常組即未加任何藥物組。②Rotenone處理48h組。③撤除Rotenone繼續(xù)自然孵育48h組，此組作為對(duì)照組。④撤除Rotenone后加入E64繼續(xù)孵育48h組。具體如下：將細(xì)胞接種到鋪有蓋玻片的24孔板內(nèi)，待進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入100nmol／L Rotenone處理48h后再換液撤除Rotenone并加入終濃度為200μmol／L的E64，繼續(xù)孵育48h后取出蓋玻片，常規(guī)處理后用冷丙酮／無(wú)水乙醇（體積比1∶1混合）室溫固定細(xì)胞10 min；加入2‰Triton X－100（體積分?jǐn)?shù)）的PBS溶液室溫作用20min；用0.1%硫磺素S孵育10min，之后移入80%的酒精分化5min，振蕩洗滌入3%牛血清白蛋白（BSA）室溫作用30min；吸出多余液體，加入山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗體（1∶100），4°C孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照組用PBS代替一抗；加入TRITC標(biāo)記的兔抗山羊熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育90min；anti－fade處理。每步后皆用PBS洗滌5min×3。熒光顯微鏡下及其相連的計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)中觀察胞質(zhì)內(nèi)α－synuclein蛋白和硫磺素S陽(yáng)性包涵體的形成。用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)拍照和圖片處理。每次每組實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。雙陽(yáng)性包涵體的細(xì)胞計(jì)數(shù)是在顯微鏡下以每孔中心十字為界，隨機(jī)選取多個(gè)視野，每組觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)含有雙陽(yáng)性包涵體的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（細(xì)胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色陽(yáng)性包涵體細(xì)胞個(gè)數(shù)／每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)×100% ）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)差異顯著性用Dunnett法，多組間比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者行方差分析；方差不齊者行成組秩和檢驗(yàn)，組間比較用Student－Newman－Keuls法檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)藥物Rotenone及撤除Rotenone后E64處理PC12細(xì)胞48h后胞質(zhì)內(nèi)α－synuclein蛋白和硫磺素S陽(yáng)性包涵體情況：正常組PC12細(xì)胞中僅有少數(shù)細(xì)胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞包涵體（3.26±0.32）%；經(jīng)100nmol／L Rotenone處理48 h后含有雙陽(yáng)性包涵體的數(shù)目明顯增加（21.15±1.58）%，撤除Rotenone后再培養(yǎng)48h后包涵體數(shù)目又明顯減少（7.23±0.75）%，上述三組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明α－synuclein蛋白模型成功建立。撤除Rotenone后再經(jīng)終濃度為200mmol／L E64處理48h后，含有陽(yáng)性包涵體的細(xì)胞數(shù)目為：（15.36±0.85）%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

α－synuclein蛋白是路易小體的重要組分，與帕金森病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，目前研究表明α－synuclein蛋白聚集主要與其降解障礙有關(guān)。但是蛋白酶體或是溶酶體降解α－synuclein，或者是兩者的共同作用尚不十分清楚。最近有研究顯示α－synuclein蛋白存在蛋白酶體和溶酶體兩條降解途徑［1－2］。最近又有研究顯示體內(nèi)存在α－synuclein蛋白酶體降解途徑和溶酶體降解途徑的分子開(kāi)關(guān)CHIP［3］。

目前研究已經(jīng)明確魚(yú)藤酮處理PC12細(xì)胞后α－synuclein蛋白增加且可以出現(xiàn)α－synuclein蛋白聚集，而去除魚(yú)藤酮后細(xì)胞內(nèi)聚集物又可消失［4］。本試驗(yàn)利用魚(yú)藤酮這一特性成功建立α－synuclein蛋白模型。我們研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用溶酶體途徑抑制劑E64作用于魚(yú)藤酮處理后的PC12細(xì)胞顯示：E64處理組出現(xiàn)α－synuclein明顯聚集且包涵體形成；依此分析αsynuclein蛋白可通過(guò)溶酶體途徑降解，另有研究顯示α－synuclein聚集后具有細(xì)胞毒性［5］，Ana Maria Cuervo等研究發(fā)現(xiàn)α－synuclein形成蛋白聚集體后，就會(huì)阻斷分子介導(dǎo)的自吞噬途徑，使溶酶體無(wú)法降解其他酶解底物，從而干擾其正常的細(xì)胞清除功能，并導(dǎo)致自吞噬作用的補(bǔ)償性激活［6］。因此我們推測(cè)自噬也可能參與了細(xì)胞的死亡過(guò)程。但到底是什么原因?qū)е铝松窠?jīng)元最后的死亡，眾多研究表明，由α－synuclein積聚所形成的包涵體在一定程度上通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡。激活自噬加速新合成的蛋白聚集物清除已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)［2，7］。然而，隨著疾病的進(jìn)展，蛋白聚集物越來(lái)越多，它們對(duì)溶酶體蛋白酶降解的敏感性下降或者溶酶體本身功能的下降，自噬的持續(xù)性激活將導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性程序性細(xì)胞死亡。由此推測(cè)細(xì)胞死亡的原因可能也與細(xì)胞溶酶體功能的下降引起蛋白聚集和自噬的持續(xù)性激活有關(guān)。而且不可否認(rèn)的是溶酶體功能確實(shí)有隨年齡增長(zhǎng)而逐漸下降的趨勢(shì)。巧合的是有一種早發(fā)性家族性PD伴有遺傳性溶酶體貯積癥［8］，有溶酶體貯積癥患者伴有帕金森綜合征［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)α－synuclein蛋白聚集也影響溶酶體功能，神經(jīng)元中變異α－synuclein表達(dá)引起溶酶體功能的失調(diào)和泛素依賴性的蛋白水解系統(tǒng)的破壞［10］。說(shuō)明溶酶體功能下降與α－synuclein蛋白聚集之間相互影響，相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。

目前研究越來(lái)越多的證據(jù)證明程序性細(xì)胞死亡不僅僅局限于凋亡，自噬為主的II型程序性死亡（PCD）也占據(jù)了重要的位置。凋亡與自噬／溶酶體途徑引起的細(xì)胞死亡之間并不是完全各自獨(dú)立，而有著大量的信號(hào)交叉。因此可以推測(cè)可能凋亡和自噬共同參與了多巴胺神經(jīng)元的變性死亡。激活自噬可加速細(xì)胞內(nèi)蛋白聚合物的清除，而這種蛋白聚合物的存在是神經(jīng)變性性疾病的典型特點(diǎn)之一［11－12］，但過(guò)度自噬又引起II型PCD。

本研究應(yīng)用農(nóng)業(yè)中廣泛使用的殺蟲(chóng)劑之一魚(yú)藤酮建立α－synuclein蛋白模型，較以往研究者用轉(zhuǎn)染α－synuclein基因建立α－synuclein蛋白過(guò)表達(dá)模型更接近于體內(nèi)真實(shí)情況，某些α－synuclein基因突變可引起家族性PD已得到證實(shí)，本研究把引起PD遺傳因素和環(huán)境因素有機(jī)結(jié)合了起來(lái)。另本研究結(jié)果顯示α－synuclein蛋白可通過(guò)溶酶體途徑降解，溶酶體途徑根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的方式不同分為3種類型：微自噬（microautophgy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone－mediated autophagy，CMA）。我們下一步將對(duì)α－synuclein蛋白溶酶體具體降解途徑及自噬的調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步深入研究。經(jīng)過(guò)上述討論及結(jié)合我們的試驗(yàn)結(jié)果，提示凋亡和自噬可能共同參與了DA能神經(jīng)元的變性死亡。深入了解DA能神經(jīng)元的II型PCD機(jī)制，將為PD的治療和預(yù)防及發(fā)病機(jī)制的闡明提供一個(gè)新的思路。

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