DNA 疫苗及其免疫途徑的研究進展

楚琰，吳興安

DNA 疫苗（DNA vaccine）又稱為核酸疫苗、基因疫苗，是指將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的質粒載體作為疫苗，采用某種方法直接導入動物細胞內，然后通過宿主細胞的轉錄翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，從而使被接種動物獲得相應的免疫保護，以達到預防和（或）治療疾病的目的。1990年，Wolff 等[1]發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌細胞能捕獲含外源基因的質粒并表達外源基因，首次提出了基因免疫的概念。1992年，Tang 等[2]將含生長激素基因的質粒導入小鼠表皮細胞，88%的被免疫小鼠產生了抗生長激素抗體，二次免疫后抗體水平顯著提高。隨后的大量動物實驗都說明在合適的條件下，DNA 接種后既能刺激機體產生細胞免疫，又能產生體液免疫。于是，基因疫苗技術應運而生，并逐漸顯示出作為第3 代疫苗的優(yōu)越性。

最近幾年來，關于基因免疫的研究在世界范圍內廣泛展開，所涉及的范圍包括人和動物的各種細菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲病及腫瘤性疾病。目前，在醫(yī)學上針對結核桿菌、艾滋病病毒、流感病毒和 T 細胞淋巴瘤的基因疫苗已進入臨床階段；而針對乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、狂犬病病毒、牛皰疹病毒、人乳頭瘤病毒感染及相關癌癥、巨細胞病毒、淋巴細胞脈絡叢腦炎病毒、瘧原蟲、利什曼病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的核酸疫苗也正處于研究和開發(fā)之中。

雖然 DNA 疫苗研究已經取得長足的進展，但多數(shù)DNA 疫苗，尤其是針對大型動物和靈長類動物的 DNA 疫苗的免疫效果仍不理想，普遍存在免疫原性低、誘發(fā)的抗體滴度低以及不能完全清除病毒感染的問題，妨礙了其進一步的臨床應用。因此，探索提高 DNA 疫苗有效性的策略和方法是目前 DNA 疫苗研制的重要環(huán)節(jié)。已有的研究表明，多種因素影響 DNA 疫苗的免疫效果，如目的基因的選擇、質粒載體的選擇、免疫佐劑的選擇等，其中免疫途徑的選擇是一個重要方面。DNA 疫苗存在多種不同的免疫途徑，不同免疫途徑和免疫方式可對抗原 DNA 的吸收、表達和遞呈產生影響，從而誘導出不同強度的免疫反應，其誘導的免疫應答機制也各不相同[3]?，F(xiàn)有資料表明，不同 DNA 疫苗最佳的接種方式不同。因此，需根據(jù)客觀情況進行優(yōu)化選擇。

本文就 DNA 疫苗免疫途徑的研究進展作一綜述。

1 注射免疫法

所謂直接注射法就是將重組質粒 DNA 直接注射到動物或人體的不同部位，如肌肉、靜脈、腹腔、皮內和皮下等。該法需要大量重組質粒 DNA，但操作簡單，無需復雜設備，是一種常用的方法。

1.1 肌肉注射

目前大部分研究者認為包括骨骼肌和心肌在內的橫紋肌系統(tǒng)是最有效的攝取外源基因的組織[4]。肌肉組織具有安全、體積大、免疫接種容量大的優(yōu)點，是一個可以長期分泌治療性蛋白的有效平臺，能引起有效的體液和細胞免疫應答，因此多被用來進行 DNA 免疫注射[5]。但是肌肉組織缺少相關的巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞，故其抗原提呈能力較弱。將質粒 DNA 注射進入肌肉組織后，最多只有1%～2%的肌纖維被轉染，而影響質粒 DNA 擴散的主要屏障是肌束膜[4]。盡管如此，但由于肌肉組織的骨骼肌細胞可通過 T 小管或溝隙攝取 DNA，且可長時間持續(xù)表達，因而其內化質粒 DNA 及表達編碼基因蛋白的能力遠優(yōu)于其他類型細胞，從而成為DNA 疫苗最主要的免疫方法之一。DNA 轉染的效率還與質粒 DNA 的大小、構型、肌細胞的狀態(tài)等有十分密切的關系。一般而言，DNA 分子越小，越有利于肌細胞的攝取，反之則擴散和攝取的效率越低。超螺旋閉合環(huán)狀雙鏈質粒構象對質粒進入肌細胞并在其中有效表達是十分有利的；而線性或開環(huán)的雙鏈質粒 DNA 的轉染效率則較低。對肌細胞而言，處于再生狀態(tài)的肌細胞攝取質粒 DNA 的能力較強。

研究表明[6]，肌肉內接種誘發(fā)的免疫類型以 Th1 型為主，包括激活 CD8+ 的 CTL，CD4+ 的 Th1 細胞以及產生 IgG2a 為主的 B 淋巴細胞，且所獲得的免疫力隨免疫次數(shù)增加而不斷加強。其產生 Th1 型優(yōu)勢應答的機制除與巨噬細胞和 NK 細胞活化產生 Th1 類細胞因子有關外，尚與肌肉的部位有關。骨骼肌所屬淋巴結為周圍淋巴結，其內有較多 Th1 類細胞及可提供 Th0 向 Th1 類細胞分化的微環(huán)境，這也是骨骼肌成為比較理想的肌注部位的原因之一。

1.2 靜脈注射

有文獻顯示[7]，靜脈注射的免疫保護效率與肌注無顯著差異。主要是由于雖然靜脈注射導入 DNA 的轉染率很低，但其內豐富的抗原提呈細胞及其對特異抗原的識別和高效提呈，能夠彌補轉染率的不足。

1.3 腹腔注射

腹腔注射由于可迅速吸引眾多巨噬細胞吞噬處理侵入的異物，所以獲得免疫應答的速度較快，應答水平較高，但維持時間較短。已有實驗證實，腹腔內注射裸 DNA 載體，可轉染脾臟的 T 淋巴細胞和骨髓來源的造血干細胞，但是，極低的轉染效率以及缺乏有效的抗原呈遞作用，使得該途徑的免疫保護效率很低。

1.4 皮內注射和皮下注射

皮膚是阻止外來病原進入體內的屏障，是一個復雜而有效的免疫監(jiān)視器官，含有大量的專職抗原提呈細胞，如郎罕細胞（LC）和樹突狀細胞（DC）。皮內注射位點多樣，實驗動物可以在尾根部（離臀部皮膚 1cm 處）、腹部皮膚、足墊和耳廓等處，不同的注射位點引起的免疫應答機制不同[8]。皮下或皮內途徑傳遞抗原可誘導出較強的體液免疫和細胞免疫應答，以 Th1 型反應為主[9-10]。研究顯示，下頜下腺附近皮下注射 DNA 疫苗是一種較好的抵御口腔感染性疾病的策略。Guo 等[11]將帶有葡糖基轉移酶（GTFs）的C 末端糖苷結合區(qū)域（GLU）基因的 pGLUA 質粒，皮下注射免疫 SD 鼠，發(fā)現(xiàn)在唾液中誘生的特異性分泌型 IgA（sIgA）滴度顯著高于經肌肉注射時唾液中的特異性 sIgA，且皮下注射途徑也可誘導出血清中特異性抗細胞表面 A蛋白（PAc）的 IgG 抗體，顯示皮下注射途徑可誘導出系統(tǒng)免疫和黏膜免疫。F?rg 等[8]以小鼠為模型，比較了三種不同的接種途徑（骨骼肌、腹部皮膚、耳廓）所誘發(fā)的免疫反應，肌肉組織中目的基因表達時間最長，耳廓免疫引起的體液和細胞免疫應答最強，肌肉免疫最弱，由此可見質粒表達持續(xù)時間與免疫反應強弱無關，而且發(fā)現(xiàn)耳廓免疫可優(yōu)先誘導基因免疫反應。

2 非注射免疫法

2.1 基因槍法（微彈轟擊法）

基因槍法是一種全新的基因導入技術，它采用金或鎢微粒為載體，以壓縮氣體（氦或氮）沖擊波為動力，把研究人員理想目標中的遺傳物質附著于高速金顆粒上，直接射入需要改造的動、植物細胞、組織或細胞器內，實現(xiàn)基因轉移。該方法具有技術簡單，能迅速、方便地轉移基因，對于任何處于靜止期或分裂期的靶細胞都可以進行基因轉移，用比普通的注射法低 2～3 個數(shù)量級的 DNA 即可產生較高的保護作用，對治療基因的大小要求不嚴格，安全性很高，可以獲得持續(xù)時間較長的瞬時表達等優(yōu)點[12]，是目前廣泛應用且十分高效的免疫方法。

基因槍免疫無論是其介導產生的抗體效價還是其所需的 DNA 疫苗劑量，均優(yōu)于肌注途徑[13]。肌內注射所需DNA 疫苗的劑量是獲得同等程度抗體反應的基因槍免疫所需 DNA 劑量的 100～1000 倍[14]。Fynan 等[7]用基因槍將甲型流感病毒的 DNA 疫苗送入小鼠的表皮中，發(fā)現(xiàn)僅用 0.4 μg 的 DNA 免疫 2 次即可使 90%的小鼠抵抗隨后的病毒攻擊，而肌內注射則需要 100 μg 的劑量。這可能是由于肌內注射途徑中 DNA 是從細胞外被攝取，而基因槍途徑則是 DNA 直接被轟擊定位至細胞漿[15]。此外，Yoshida 等[16]還發(fā)現(xiàn)基因槍介導的免疫實驗重現(xiàn)性遠遠好于肌肉注射。但是基因槍設備昂貴，子彈制作成本高，目前尚不具備普遍使用的條件。

2.2 表皮劃痕法

所謂表皮劃痕法即先用 70%酒精擦洗小鼠耳背皮膚，然后以注射針頭劃痕，再將溶于含 1%SDS 的 TE 溶液中的質粒 DNA 涂于劃痕部位，其中 SDS 為透皮吸收促進劑。段明星等[17]將乙型肝炎病毒表面抗原基因質粒pGFP-HBsAg，分別采用肌肉注射、腹腔注射、表皮劃痕三種免疫途徑和不同劑量的裸露質粒 DNA 給小鼠進行免疫，以 ELISA 檢測小鼠血清中抗 HBsAg 抗體變化。結果表明表皮劃痕方式免疫的小鼠陽性率最高，且在相同劑量下其抗體滴度水平也最高，反應強度與他們曾經使用基因槍免疫的實驗結果相似。但這方面工作還需進一步研究，以尋求更好的方法來提高基因轉移效率，獲得最佳免疫效果。

2.3 黏膜免疫法

黏膜免疫系統(tǒng)是機體免疫網絡中重要的組成部分。黏膜表面是大部分病原生物侵入機體的主要部位。與非黏膜免疫相比，黏膜免疫除可引起機體產生全身免疫應答（如 IgG）外，還可誘導黏膜免疫應答，產生 sIgA，從而有效地提高機體的免疫保護力；同時，該免疫方法還具有給藥途徑安全、簡便、無創(chuàng)傷等優(yōu)點[18]。非侵入性黏膜免疫途徑包括鼻內吸入、滴鼻、直腸內給藥、陰道內給藥、滴眼、口服、口內噴射接種等。據(jù)報道，所有黏膜免疫途徑中以滴鼻效果最好。因為鼻腔上皮易接種，對大分子物質較少排斥，表面蛋白酶水平低于腸道[19]。Mora 和 Tam[20]報道，給麻醉小鼠鼻腔免疫包裹 HIV-1 包膜糖蛋白 gp120 的肽聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）微球可誘導出 gp120 相關的 CTL 和免疫應答，也能引起小鼠全身 CTL 應答。

黏膜免疫的機制包括誘生 sIgA、產生抗原提呈細胞介導的細胞毒作用以及誘導產生調節(jié)型 T 細胞[19]等。

2.4 電穿孔技術傳遞質粒 DNA

上述傳遞 DNA 疫苗的不同途徑和方法，一般在小動物體內比靈長類動物體內更有效。到目前為止，僅少數(shù)實驗在人體內觀察到特異性的免疫反應，而在大量實驗中并未觀察到特異性的免疫反應[21-22]。在靈長動物體內未誘導出免疫反應的可能原因是 DNA 攝取量低，而電穿孔技術可克服這一難題。電穿孔通過脈沖電流增加靶細胞的滲透性而不致殺傷細胞，使親水藥物和 DNA 可以透過細胞膜；電穿孔技術能有效地傳遞質粒 DNA 至皮膚，在鼠、豬和靈長類動物模型中質粒 DNA 的表達提高了 100 倍，但其具體機制不清[23]。Schertzer 等[24]研究顯示：用透明質酸酶預處理小鼠脛前肌，在 75 V/cm 的條件下進行電穿孔，經檢測肌纖維表達報告基因率達 22%±5%，而且不會引起肌肉組織損傷。Otten 等[25]將 HIV 的 DNA 疫苗用電穿孔技術接種至獼猴體內，研究發(fā)現(xiàn)攻擊感染的強度，與獼猴產生特異性抗體和細胞免疫反應持續(xù)的時間呈一定關聯(lián)，提示利用電穿孔針對大動物傳遞質粒 DNA 是一項非常有效的技術。

3 非常規(guī)的其他免疫途徑

上文所述的各種免疫途徑是目前 DNA 疫苗應用較多的、較常規(guī)的免疫途徑，除此之外，近些年還涌現(xiàn)出了一些新的非常規(guī)的免疫途徑。其中，經涎腺投遞基因疫苗的方式具有免疫原性強、安全性好等優(yōu)點而受到人們重視。涎腺基因投遞是將外源基因經導管逆行灌注投遞至涎腺，繼而表達基因所編碼的蛋白質并將其分泌至血液或唾液，起到基因治療的作用[26]。

涎腺是外分泌腺體，與皮膚和肌肉組織不同的是，涎腺的解剖與生理功能使其成為基因轉導和蛋白表達的理想器官[27]，其解剖特點特別適用于基因疫苗的投遞[28]：①涎腺有蛋白合成及分泌系統(tǒng)；②涎腺腺體分泌的蛋白可經基底膜至血液，經頂膜至唾液；③涎腺可通過導管系統(tǒng)無創(chuàng)逆行注射各種基因；④腺體的腺泡和導管均由單層細胞構成，一次注射即可將基因投遞到絕大多數(shù)細胞；⑤經導管投遞基因較經血液投遞后針對載體的免疫反應及炎癥反應輕得多。研究表明，經涎腺投遞的基因疫苗不僅能夠誘導體液免疫和細胞免疫，還能誘導強烈的黏膜免疫[29-32]。Voutetakis 等[33]把攜帶人促紅細胞生成素基因的腺病毒相關病毒載體投遞至小鼠涎腺，基因轉導后 10 周分泌入血液中的人促紅細胞生成素濃度達到最高，轉基因穩(wěn)定表達 54 周以上，小鼠的血液紅細胞壓積明顯提高，且與血清促紅細胞生成素含量呈正相關。王松靈等[34-37]在大鼠與小型豬體內經導管逆行投遞基因轉導研究的基礎上進一步在小型豬涎腺放射損傷動物模型上轉導水通道基因獲得成功[36]，證明大型動物體內經涎腺逆行投遞基因的可行性。經涎腺投遞基因疫苗，可以預防或治療口腔、消化道或全身疾病，雖然這方面的研究才剛剛起步，但其有潛在的發(fā)展前景。

4 多種途徑聯(lián)合免疫

研究表明，多種免疫途徑聯(lián)合使用策略，其免疫效果優(yōu)于單種途徑的免疫。Kudo-Saito 等[38]比較了用含有癌胚抗原（CEA）和三聯(lián)的 T 細胞共刺激分子（B7-1、ICAM-1、LFA-3）的痘苗病毒（rV-CEA /TR ICOM）經不同途徑接種的免疫效果和保護率，其免疫效果為初免皮下接種，再瘤內接種加強的聯(lián)合免疫策略要優(yōu)于皮下接種和瘤內接種單獨免疫。Fynan 等[7]比較了甲型流感病毒血凝素 DNA 疫苗經不同途徑接種的免疫效果和保護率，結果無論是小鼠還是雞，其免疫效果均以多種途徑聯(lián)合免疫為最好。

5 結語

DNA 疫苗是 21 世紀新型疫苗發(fā)展的趨勢，它不僅有可能成為病毒、細菌或寄生蟲等感染性疾病的預防性疫苗，同時也可能作為非感染性疾病、腫瘤、自身免疫疾病等的治療性疫苗。目前，DNA 疫苗已成為疫苗研究領域中的熱點之一。DNA 疫苗的接種有多種途徑，不同的免疫途徑，誘導免疫保護力的強弱和維持的時間也不盡相同。各種途徑各有自身的優(yōu)缺點。一般來說，皮內注射（耳廓）誘導的免疫應答較強，肌肉注射誘導的免疫持續(xù)時間較長，黏膜免疫不僅誘導黏膜免疫還可誘導系統(tǒng)免疫，電穿孔技術對大動物免疫效率較高，基因槍免疫質粒用量少，免疫效果較好，而各種接種途徑的聯(lián)合運用可能是新的研究方向。今后，還需要進一步研究，闡明各種接種途徑的免疫機制，以尋求更好的接種方法來提高基因轉移的效率，獲得最佳的免疫保護效果。

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