HPLC法測定豆腐渣果中豆腐果苷的含量

楊勝，蘇柘僮，楊明

豆腐渣果為山龍眼科山龍眼屬（Helicia）植物深綠山龍眼（Helicia nilagirica Bedd）的種子，其有效成分豆腐果苷（Helicid，對苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷）的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于天麻苷（Gastrodin，對羥甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）[1]。藥理研究表明，豆腐果苷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用與天麻苷相似，但其鎮(zhèn)靜止痛作用較天麻苷強，對神經(jīng)官能癥引起的頭痛、頭昏、睡眠障礙的治療作用顯效快[2]。因此，豆腐渣果在神經(jīng)官能癥治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已有以豆腐果苷為主要原料的市售品種豆腐果苷片，用于緩解神經(jīng)官能癥引起的頭痛、頭昏及睡眠障礙，輔助治療原發(fā)性頭痛[3]。雖然目前關(guān)于豆腐渣果化學(xué)成分、藥理作用方面的研究報道較多，但是關(guān)于豆腐渣果含量測定方法的研究報道卻較少。鑒于此，本文擬建立 HPLC 測定豆腐渣果中豆腐果苷含量的方法，為豆腐渣果的進一步應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 豆腐渣果購自成都市荷花池藥材市場；豆腐果苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100385-200401）購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純乙腈購自美國 Fisher 公司；重蒸水為成都中醫(yī)藥大學(xué)炮制與制劑教研室自制；微孔濾頭（0.45 μm）購自美國 Millipore 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 HPLC 儀（LC-10ATvp 輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測器、CT-10ASvp 柱溫箱）為日本島津公司產(chǎn)品；N2000 HPLC 工作站為浙江大學(xué)智達信息工程有限公司產(chǎn)品；BP211D 型電子分析天平為德國 Sartorius 公司產(chǎn)品；KQ-400DB 數(shù)控超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DZF-1B 真空干燥箱為上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備和色譜條件 取豆腐果苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定 4.70 mg，置 250 ml 量瓶中，加水約 250 ml，超聲處理 5 min 后取出，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻即獲得濃度為 18.8 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行全波長掃描，掃描范圍 200～700 nm，結(jié)果顯示在 270 nm處有最大吸收，因此采用 270 nm 作為實驗檢測波長。

參照文獻[4]以及預(yù)試結(jié)果確定色譜條件：色譜柱為菲羅門 Luna-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-冰醋酸（8∶91∶1），流速 1.0 ml/min，柱溫室溫，進樣量為 5～10 μl。

1.2.2 HPLC 系統(tǒng)適用性檢測 以上述色譜條件，分別對豆腐果苷樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為 18.8 μg/ml）進行理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子實驗，各平行實驗 5 次。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 樣品溶液制備

⑴提取方法與溶媒種類：參照文獻[4]以及預(yù)試結(jié)果，以水為溶媒，采用超聲提取方法。

⑵提取時間的考察：取豆腐渣果 100 mg，加入 100 ml水，分別超聲提取 30、45、60 min 制備樣品溶液。

以上述色譜條件分別對提取時間 30、45、60 min 三個水平進行考察，各平行實驗 3 次。

⑶取樣量的考察：分別取豆腐渣果 60、80、100 mg，加入 100 ml 水，超聲提取 30 min 制備樣品溶液。

以上述色譜條件分別對取樣量 60、80、100 mg 三個水平進行考察，各平行實驗 3 次。

1.2.3.2 專屬性考察 分別配制空白溶液、對照品溶液、樣品溶液，以上述色譜條件進行實驗。

1.2.3.3 線性與范圍考察 取濃度為 18.8 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以上述色譜條件進樣測定。以進樣量（μg）為 X，峰面積（mV·min）為 Y，做線性回歸。

1.2.3.4 精密度考察 取同一豆腐渣果樣品 6 份，各約100 mg，分別加入 100 ml 水，超聲提取 30 min 制備樣品溶液。按照上述色譜條件，平行測定 6 次。

1.2.3.5 穩(wěn)定性考察 分別取樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為 18.8 μg/ml），按照上述色譜條件，對穩(wěn)定性進行考察。

1.2.4 樣品含量測定 取 6 份豆腐渣果樣品，各約100 mg，精密稱定后置于 100 ml 量瓶中，加水約 100 ml，超聲處理 30 min，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻后濾過（0.45 μm），制備樣品溶液，根據(jù)上述色譜條件，分別測定樣品中豆腐果苷含量。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 系統(tǒng)適用性

結(jié)果理論塔板數(shù)按豆腐果苷計算平均為 12003，故確定理論塔板數(shù)按豆腐果苷計算不應(yīng)低于 8000；分離情況良好，故確定分離度不應(yīng)低于 1.5；拖尾因子平均為 1.01，表明峰型良好；HPLC 儀重復(fù)性指標(biāo)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.30%，表明儀器重復(fù)性良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 樣品溶液制備 通過對提取時間和取樣量的考察，確定提取時間為 30 min，取樣量為 100 mg（表 1、表 2）。樣品溶液配制方法為：取適量樣品細粉約 100 mg，精密稱定，置 100 ml 量瓶中，加水約 100 ml，超聲處理 30 min 后取出，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻，濾過（0.45 μm）后取續(xù)濾液，即獲得樣品溶液。

表1 樣品溶液制備的提取時間考察（，n = 3）

表1 樣品溶液制備的提取時間考察（，n = 3）

時間（min） 豆腐果苷含量（%）30 1.81 ± 0.0345 1.76 ± 0.0460 1.83 ± 0.08

2.2.2 專屬性考察 HPLC 分析顯示各成分和溶劑之間無干擾，表明該方法專屬性良好（圖 1）。

表2 樣品溶液制備的取樣量考察（，n = 3）

表2 樣品溶液制備的取樣量考察（，n = 3）

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表3 HPLC 測定豆腐果苷的線性與范圍考察結(jié)果

圖1 HPLC 測定豆腐果苷的專屬性考察（A：空白溶液；B：對照品；C：樣品）

表4 HPLC 法測定樣品中豆腐果苷的加樣回收率（n = 3）

2.2.3 線性與范圍考察 結(jié)果表明豆腐果苷在 0.047～0.282 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.9997），回歸方程為：Y = 3 × 106X + 9245.3（表 3）。

2.2.4 精密度與穩(wěn)定性考察 精密度結(jié)果顯示 RSD 為3.23%，表明該方法精密性較好。穩(wěn)定性結(jié)果顯示樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的 RSD 分別為 1.04%、1.30%，表明樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率考察 結(jié)果顯示樣品的加樣回收率在94.63%～103.59% 之間，RSD為 3.09%（表 4），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品含量測定

采用 HPLC 方法測定 6 份豆腐渣果樣品中豆腐果苷含量，結(jié)果顯示樣品中豆腐果苷含量范圍為 1.68%～1.84%，平均含量為 1.75%（表 5）。

表5 豆腐渣果樣品中豆腐果苷含量的HPLC 法檢測結(jié)果

3 討論

豆腐渣果為云南民間藥材，歷代本草未見記載。豆腐渣果中可能含有與豆腐果苷結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，結(jié)合含量測定中樣品峰只有一個單峰的現(xiàn)象，考慮到可能該單峰由豆腐果苷與其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)所產(chǎn)生，其色譜行為相似，較難分離，且出峰時間重合，因此需要對該單峰的純度進行檢驗以鑒別該峰是否僅為豆腐果苷單峰，而不含有其他雜質(zhì)。

為此，照上述的含量測定方法，我們制備了兩份樣品以及一份對照品，采用安捷倫 1200 二極管陣列檢測器對三個供試品的峰純度進行檢驗。結(jié)果顯示，通過峰純度檢驗判別該峰與對照品純度相似為較純物質(zhì)。這一探索性研究結(jié)果保證了本含量測定方法的科學(xué)性。

綜上，本研究結(jié)果顯示建立的 HPLC 方法精密度高，重復(fù)性及線性關(guān)系良好，回收率滿意，方法科學(xué)、合理、可行，符合簡便、快速、準(zhǔn)確的要求，為豆腐渣果藥材含量測定方法提供了參考，為豆腐渣果提取工藝研究奠定了基礎(chǔ)，也為豆腐渣果的應(yīng)用研究提供了有力支持。

[1]Zhao JP, Pan WE, Chen WX.Studied on the chemical constituents of helicia pyrrhoeotrya.Nat Product Res Dev, 1992, 4(4):35-40.(in Chinese)趙勁萍, 潘維恩, 陳維新.焰序山龍眼植物化學(xué)成分的研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1992, 4(4):35-40.

[2]Jia MY, Yang YH, Liu JY, et al.The research progress of Helicia nilagirica Bedd.J Traditional Chin Vet Med, 2007, (2):27-29.(in Chinese)賈美艷, 楊永紅, 劉君英, 等.豆腐果的研究進展.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2007, (2):27-29.

[3]Zhao JG, Luo RF.Extraction process for helicid from helicid nilagirica beed.Chin J Pharm, 1991, 22(11):485- 486.(in Chinese)趙建國, 羅瑞芳.豆腐果甙提取工藝改進.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1991, 22(11):485-486.

[4]Liu QF, Ye L, Luo GA, et al.HPLC determination of helicidum in helicidum tablets.Chin J Pharm Anal, 26(10):1392-1394.(in Chinese)劉清飛, 葉磊, 羅國安, 等.HPLC法測定豆腐果苷片中豆腐果苷的含量.藥物分析雜志, 2006, 26(10):1392-1394.