使用優(yōu)化PAGE電泳及銀染技術(shù)檢測(cè)臨床糞便樣品中的輪狀病毒RNA

楊昭慶，黃永坤，劉馨

人輪狀病毒腸炎是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要的健康問題，也是引起兒童腹瀉并導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]。快速有效地分離、鑒定臨床糞便樣中的輪狀病毒，不僅可以確證輪狀病毒的感染，還可以準(zhǔn)確監(jiān)控輪狀病毒流行株的變化，積累輪狀病毒的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。輪狀病毒的基因組為雙鏈RNA，分為 11 個(gè)節(jié)段，不同株型輪狀病毒的 RNA 電泳圖譜存在差異，可由此初步判定輪狀病毒株型別[2]。本文以猴輪狀病毒 SA11 株的 RNA 基因組作為模版，對(duì) PAGE電泳和銀染的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，并使用優(yōu)化后的條件對(duì)臨床糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

猴輪狀病毒 SA11 株為本所保存；12 份臨床樣品來自云南昆明醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，為兒科急性腹瀉小兒糞便樣本，收集的時(shí)間為 2009 年 11 月，隨機(jī)編號(hào) 1～12 號(hào)；A 群輪狀病毒膠體金診斷試紙購自北京萬泰生物藥業(yè)有限公司；小量液體樣品 RNA 抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；小型垂直電泳槽購自 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

在不改變電泳設(shè)備的前提下，以猴輪狀病毒 SA11 株為模版，對(duì)其 RAN 基因組的電泳條件進(jìn)行了比較和優(yōu)化，包括不同丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比、分離膠、積層膠濃度、電壓、電泳時(shí)間，銀染的染色和顯色時(shí)間。并以優(yōu)化后條件對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的不同代次的輪狀病毒 RNA 基因組進(jìn)行檢測(cè)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定其穩(wěn)定性。

PAGE 電泳的緩沖液為 TBE，電泳結(jié)束后，使用 10%無水乙醇和0.5% 的冰乙酸洗滌凝膠 2 次，每次 5 min，然后使用 0.2% 的硝酸銀溶液染色，顯色液為 NaOH 和甲醛溶液。

使用 A 群輪狀病毒膠體金診斷試紙對(duì)腹瀉樣品進(jìn)行快速檢測(cè)（具體方法參照該產(chǎn)品說明書），將陽性樣品用20 mmol，pH 7.4 的 PBS 制成 10% 懸液，于 3724 × g 條件下，離心 30 min。上清用 0.2 μm 濾膜過濾后，取 250 μl濾液用 RNA 抽提試劑盒提取病毒 RNA，取 10 μl RNA 抽提物，然后進(jìn)行 PAGE 電泳和銀染檢測(cè)。

2 結(jié)果

對(duì) PAGE 電泳的條件優(yōu)化如下：采用的聚丙烯酰胺凝膠選用了不同的丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比，分別為 37.5∶1、29∶1、20∶1 和7.25∶1，分離膠濃度從 5%～20%，電泳時(shí)間從 3～15 h，電壓從 60～120 V（表 1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比為29∶1 的凝膠，3.5% 基層膠，10% 分離膠，以 60 V 電泳6 h，輪狀病毒 RNA 基因組的 11 個(gè)節(jié)段可獲得較好的分離。其次我們對(duì)銀染的條件進(jìn)行了優(yōu)化，比較了染色時(shí)間和顯色時(shí)間的長短對(duì)同一樣品染色效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用新鮮配制的硝酸銀溶液，染色 2 min 即可，延長時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒有影響，顯色時(shí)間控制在 5 min 以內(nèi)，可以有效地降低背景染色，提高對(duì)比度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該方法用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的不同代次的輪狀病毒 RNA 基因組，結(jié)果穩(wěn)定[3]。

表1 不同凝膠濃度、電泳時(shí)間及電壓對(duì)分離效果的影響

利用上述條件對(duì)臨床糞便樣品中的輪狀病毒 RNA 基因組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 號(hào)和4 號(hào)樣品的 RNA 濃度較低，但是仍能看到輪狀病毒的特異基因組帶型，1 號(hào)和6 號(hào)的電泳背景較深，可能與糞便樣品的成分有關(guān)，5 號(hào)樣品的帶型與 Wa 株相似，6 號(hào)和7 號(hào)的型別還有待于進(jìn)一步的鑒定。

用 A 群輪狀病毒膠體金試紙檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，12 份糞便樣品中有 5份樣品為抗原陽性，分別為 1、4、5、6、7 號(hào)樣品。我們采用上述優(yōu)化后的方法，對(duì)這 5 個(gè)樣品抽提的RNA 進(jìn)行檢測(cè)（圖 1）。

圖1 臨床糞便樣品 1、4、5、6、7 號(hào)中輪狀病毒 RNA 基因組的電泳圖譜

3 討論

輪狀病毒的雙鏈 RNA 基因組在凝膠電泳時(shí)分為 11個(gè)節(jié)段，7、8、9 三個(gè)條帶的分子量較為相近：第 7 條 RNA與第 8 條 RNA 的大小相差 45 bp；而第 8 條 RNA 與第9 條 RNA 僅相差 3 bp，使用本文所述電泳設(shè)備，其制膠長度為 5 cm，這 3 個(gè)條帶沒有得到有效地分離，選用較長的凝膠可以解決這個(gè)問題，但是因?yàn)檫@ 3 條帶的電泳圖譜在輪狀病毒株型之間差異不明顯[4]，因此目前的結(jié)果已經(jīng)滿足實(shí)驗(yàn)樣品的檢測(cè)需要。

聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法（PAGE-SS）作為檢測(cè)輪狀病毒 RNA 基因組的方法被廣泛使用[5]，但是實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件的差異影響電泳結(jié)果，使得實(shí)驗(yàn)不僅耗時(shí)長，而且結(jié)果不具有可比性。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，比較了凝膠濃度、電泳時(shí)間、電壓、銀染的染色和顯色時(shí)間等參數(shù)對(duì) PAGE 結(jié)果的影響，優(yōu)化得到了一個(gè)穩(wěn)定快速的輪狀病毒 RNA 基因組 PAGE-SS 檢測(cè)方法。

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