基于礦石納米材料的DNA轉(zhuǎn)化的機(jī)理初探及方法改進(jìn)

譚海東，王磊，林金濤，趙宗保

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部，大連 116023

微生物的 DNA轉(zhuǎn)化方法是基因工程中的重要內(nèi)容，目前對微生物轉(zhuǎn)化主要有化學(xué)法和電轉(zhuǎn)化法[1]。但這些轉(zhuǎn)化方法，仍然存在許多缺點(diǎn)，比如感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)間長，處理過程容易導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，處理后要有溫育等過程。2001年，Yoshida等發(fā)表了一系列關(guān)于使用溫石棉 (Chrysotile asbestos) 實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對原核生物轉(zhuǎn)化的有趣方法[2-5]，這種方法被命名為Yoshida效應(yīng)。但是這種方法仍然有很多缺點(diǎn)：操作繁瑣、利用的介質(zhì)對人體致癌等。對該法的可靠性有很多質(zhì)疑，限制了它的應(yīng)用[6]，所以這種新穎的DNA轉(zhuǎn)化法很少被其他科學(xué)家引用。

最近，這種方法又進(jìn)一步被Wilharm等改進(jìn)[6]。他們使用的一種價(jià)格便宜、資源豐富、對人類健康友好的礦石納米材料海泡石 (Sepiolite) 作為介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了對多種微生物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。作者在本方法中使用的參數(shù)與 Yoshida等報(bào)道的一致，并根據(jù)后者的報(bào)道，提出了借助海泡石進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化的相同機(jī)制。問題是海泡石和溫石棉屬于不同的介質(zhì)：前者沒有生物活性，后者有一定的生物活性；前者對人體友好，而后者可以致癌等。因此，我們認(rèn)為這種新的轉(zhuǎn)化方法，可能會存在不同的DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制。Wilharm 等雖然對方法進(jìn)行了改進(jìn)，但該工作是以非常短的通訊形式報(bào)道，很多參數(shù)未優(yōu)化。我們認(rèn)為對這種轉(zhuǎn)化機(jī)制的充分理解和對該試驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化，會促進(jìn)這種方法的推廣和實(shí)現(xiàn)對特殊物種的DNA轉(zhuǎn)化。為此，我們進(jìn)行了本研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

pET15b質(zhì)粒有本組保存。E. coli DH5α菌株購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。短乳酸桿菌Lactobacillus brevis AS 1.579購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

蛋白酶K、250 bp DNA marker購自TaKaRa公司大連分公司。200~300 bp的RNA從短乳酸桿菌AS 1.579提取，在本組保存。海泡石購自德國Kremer Pigmente有限公司 (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG，Hauptstr. 41?47DE 88317 Aichstetten，Germany)，產(chǎn)品編號 58945。溶菌酶、鹽酸胍、十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)、苯酚和瓊脂糖購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。其他培養(yǎng)基及生化試劑牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、氯仿和異戊醇等均為分析醇，購自大連博諾生物化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 海泡石懸浮液和培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

海泡石懸浮液根據(jù)文獻(xiàn)準(zhǔn)備4%儲存液[6]：海泡石121℃滅菌20 min；用去離子水配含200 mmol/L KCl，5 mmol/L HEPES緩沖液，用NaOH調(diào)pH到7.4，過膜除菌。最后配成5% (W/V) 海泡石儲存液。另外配10×海泡石緩沖液 (2 mol/L KCl，50 mmol/L HEPES，7.4) 備用。

LB培養(yǎng)基：在950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，搖動容器直至溶解，用NaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 L。取200 mL，加入3 g瓊脂粉。在120℃滅菌20 min。待溫度降到50℃左右，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，準(zhǔn)備40個(gè)抗性平板。

MRS培養(yǎng)基的配制：1 L蒸餾水中溶解下列組分：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂 200 mg，硫酸錳50 mg，用高壓鍋在121℃滅菌15 min，調(diào)pH到6.8。其中葡萄糖單獨(dú)滅菌。

1.2.2 海泡石吸附pET15b試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的試驗(yàn)

從于 37℃培養(yǎng) 20 h的新鮮平板中挑取一個(gè)E. coli DH5α單菌落，接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌懸液以1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h至OD600=0.5左右。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10 min, 然后于4℃下4 000 r/min離心10 min。棄去上清，用預(yù)冷的海泡石緩沖液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，4℃下4 000 r/min離心10 min。最后用2 mL的海泡石緩沖液懸浮，置于冰上備用。

取40 μL pET15b溶液 (100 ng/μL)，加入10 μL的5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合，取5 μL備用。剩余的溶液12 000 r/min離心30 s，用1 mL的海泡石緩沖液連續(xù)洗滌 2次。吸附結(jié)果用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

取備用的細(xì)胞50 μL，加入5 μL質(zhì)粒飽和的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%)，充分混合。取備用的細(xì)胞50 μL，加入1 μL洗滌后的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%)，充分混合。將2種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂抹30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.3 利用海泡石對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化

海泡石緩沖液對DNA轉(zhuǎn)化率的影響：取備用的細(xì)胞50 μL 2份，1份用LB洗滌細(xì)胞，另外1份仍然保留海泡石緩沖液。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將2種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

細(xì)胞濃度對DNA轉(zhuǎn)化率的影響：分別取備用的細(xì)胞500 μL、50 μL和5 μL，前者通過離心后用50 μL海泡石緩沖液懸浮，后者加入45 μL海泡石緩沖液懸浮，這樣 3個(gè)樣品的 OD600分別是 200、20和2。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將3種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

海泡石的濃度對DNA轉(zhuǎn)化率的影響：分別取備用的細(xì)胞50 μL 3份，分別配成海泡石終濃度為1%，0.1%和0.01%的混合液。分別加入10 ng pET15b充分混合。將3種懸浮液加到3個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

涂板次數(shù)和預(yù)干處理對DNA轉(zhuǎn)化率的影響：取備用的細(xì)胞50 μL 7份，分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將4份懸浮液加到4個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板分別均勻涂抹10次、20次、40次和100次，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。另外3份細(xì)胞，1份立即用玻璃板均勻涂平板30 s，第2份10 min后用玻璃板均勻涂平板30 s，第3份20 min后用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 利用海泡石對pET15b直接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α單菌落

取4℃存放1個(gè)月的E. coli DH5α單菌落，加入20 μL海泡石緩沖液，加入100 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將細(xì)胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取

為了獲得短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA，該加入100 μL 5 mol/L NaCl混勻，再加入80 μL的CTAB/NaCl混勻，65 ℃ 10 min。加入固體的鹽酸胍至終濃度6 mol/L[10]，待細(xì)胞徹底裂解后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液 (25∶24∶1)，混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。12 000 r/min離心10 min。沉淀用 75%的乙醇洗滌，晾干，最后用20 μL TE溶解，取3 μL電泳檢測。

1.2.6 小片段RNA對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的影響

取1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，加入5 μL小片段的RNA提取液 (200 ng/μL)，充分混合，讓海泡石飽和吸附RNA。加入10 ng pET15b和備用的細(xì)胞50 μL，充分混合。將細(xì)胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養(yǎng)過夜。并與不加小片段RNA的作對照。提取使用不加 RNAase的基因組提取方法，參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[7]，并對此方法進(jìn)行優(yōu)化。簡述如下：取單克隆短乳酸桿菌到10 mL MRS培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按 1∶50接入 100 mL MRS中，200 r/min、37℃培養(yǎng)至OD600=0.5。10 000 r/min離心30 s，收集沉淀，使用500 mmol/L的EDTA洗滌3次，最后用2 mL的500 mmol/L EDTA懸浮，200 W微波處理1 min[8-9]。10 000 r/min離心30 s收集沉淀，取50 mg菌體用400 μL TE重懸于1.5 mL離心管中，加入終濃度為10 mg/mL溶菌酶，10 mmol/L的DTT，37℃保溫1 h。加入50 μL蛋白酶K (10 mg/mL)，混勻，65℃，1 h。

2 結(jié)果

2.1 海泡石吸附pET15b試驗(yàn)

從圖1可以看出，用pET15b飽和后的海泡石，經(jīng)過海泡石緩沖液充分洗滌后的海泡石幾乎檢測不到DNA。此結(jié)果說明海泡石對質(zhì)粒的pET15b吸附能力很弱，幾乎看不到DNA吸附。用pET15b飽和的海泡石轉(zhuǎn)化細(xì)胞，長出的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于洗滌后的海泡石轉(zhuǎn)化數(shù) (圖2，16-17)。這些結(jié)果說明，利用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，有可能不是海泡石將DNA帶入宿主內(nèi)的，而是由海泡石在宿主表面產(chǎn)生的瞬間小孔，導(dǎo)致DNA的隨機(jī)進(jìn)入。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測海泡石吸附pET15b能力Fig. 1 Analysis of 1% agarose electrophoresis for the ability of sepiolite absorbing pET15b. 1: pET15b; 2: the sepiolite absorbing pET15b saturatedly; 3: the sepiolite saturated with DNA was washed once; 4: the sepiolite saturated with DNA was washed two times.

圖2 海泡石用于E. coli DH5αDNA轉(zhuǎn)化的參數(shù)優(yōu)化Fig. 2 Optimization of DNA transformation for E. coli DH5α based on sepiolite. 1?2: the effect of sepiolite buffer for transformation. 3?5: the cell concentration is OD600=200, 20 and 2 in sample 3, 4 and 5 respectively. 6?8: the percent content of sepiolite is 1%, 0.1% and 0.01% in sample 6, 7 and 8 respectively; 9?12: the circulating times are 10, 20, 40 and 100 in sample 9, 10, 11 and 12 respectively. 13?15: the pre-dry treatment is 0 min, 10 min and 20 min in sample 13, 14 and 15 respectively; 16?17: washing effect for transformation; 18?19: the effect of RNA treatment for transformation.

2.2 利用海泡石對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 緩沖液

試驗(yàn)結(jié)果表明，使用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率略高于使用海泡石緩沖液 (圖2，1~2)。另外海泡石緩沖液配制和過膜除菌的操作繁瑣，利用培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將使轉(zhuǎn)化變得更加直接。

2.2.2 細(xì)胞濃度

細(xì)胞濃度是決定轉(zhuǎn)化率高低的重要參數(shù)，我們研究表明當(dāng)細(xì)胞濃度在OD600=20時(shí)轉(zhuǎn)化率最高 (圖2，3~5)。不同于電轉(zhuǎn)，細(xì)胞濃度越高轉(zhuǎn)化率越高。這可能與海泡石物理運(yùn)動空間需要有關(guān)，細(xì)胞濃度太高，海泡石纖維不能充分運(yùn)動，限制了質(zhì)粒對細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化。

2.2.3 海泡石濃度

試驗(yàn)結(jié)果表明使用海泡石的濃度比報(bào)道的高了近10倍，而轉(zhuǎn)化率有5倍以上增加 (圖2，6~8)。我們認(rèn)為使用0.1%的海泡石濃度，而不是0.01%，轉(zhuǎn)化率會更高些。具體原因不很清楚，是否由于不同批次產(chǎn)品之間存在納米纖維材料數(shù)量的差異。

2.2.4 涂平板次數(shù)和狀態(tài)

菌液不經(jīng)預(yù)干處理，直接涂抹平板，隨著涂抹次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸增加 (圖2，9~12)。另外，隨著預(yù)干處理時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化率會逐漸降低 (圖2，13~15)。

2.3 利用海泡石對pET15b直接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α單菌落

在 4℃儲存 1個(gè)月的單菌落，利用海泡石仍然可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取 4℃儲存 1個(gè)月的單菌落，利用海泡石直接轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率低于 100/μg pET15b。但是，該操作大大節(jié)省了時(shí)間，不需要轉(zhuǎn)化前的再培養(yǎng)，沒有感受態(tài)制備或超低溫凍存和轉(zhuǎn)化后的溫育等過程。同時(shí)單菌落的直接轉(zhuǎn)化，由于菌量過少，通過鈣轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)難以實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，本操作不適用于對轉(zhuǎn)化率要求非常高的實(shí)驗(yàn)，但可以在條件非常落后的實(shí)驗(yàn)室中普及。該操作也可用于某些特殊的實(shí)驗(yàn)，比如某些致病菌對抗性質(zhì)粒的易感染性等。

2.4 短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取

為了得到理想化的RNA小片段，采取基因組提取方法得到降解的RNA片段。經(jīng)過該試驗(yàn)，可以從短乳酸桿菌得到理想的小片段RNA：濃度較高，大于200 ng/μL；分子量在300 bp左右 (圖3)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，非常適合用于海泡石上 DNA競爭結(jié)合試驗(yàn)。同時(shí)，我們也嘗試了其他微生物的RNA提取，但是得到的RNA總是一條模糊的帶，分子量集中在500 bp和2 kb之間，不符合本試驗(yàn)的需要。對這種結(jié)果的差異，無法從試驗(yàn)過程中得知。

圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取Fig. 3 Analysis of 1% agarose for small RNA extraction from Lactobacillus brevis AS1.579. M: marker; 1: small RNA.

2.5 小片段RNA對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的影響

經(jīng)小片段RNA飽和的海泡石轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，與對照組相比，幾乎沒有什么變化 (圖2，18~19)。同樣說明，利用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，有可能不是海泡石帶 DNA進(jìn)入宿主內(nèi)，而是由海泡石在宿主表面產(chǎn)生的瞬間小孔，導(dǎo)致外源DNA的隨機(jī)進(jìn)入。

3 討論

利用海泡石轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；這種介質(zhì)對人體健康友好，無致癌物質(zhì)；本身無生物活性，不會對宿主生長產(chǎn)生影響；操作過程中不需特殊的設(shè)備；不需要感受態(tài)的制備就可以得到較高的轉(zhuǎn)化率；另外，資源豐富、價(jià)格便宜，使這種轉(zhuǎn)化方法容易推廣。

但是，關(guān)于基于礦石海泡石納米材料的 DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然不很清楚。Yoshida等利用溫石棉進(jìn)行DNA試驗(yàn)，提出競爭機(jī)制，即海泡石溫石棉大量吸附DNA，借助涂平板的機(jī)械摩擦力，纖維絲插入宿主內(nèi)。宿主內(nèi)的RNA與海泡石溫石棉上的DNA競爭，從而實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)υ松锏霓D(zhuǎn)化[6,11]。Wilharm等對此方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用無生物活性，對人環(huán)境友好的海泡石進(jìn)行了DNA轉(zhuǎn)化。但他們提出的轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然與 Yoshida等報(bào)道的相同。而我們試驗(yàn)表明海泡石吸附DNA的能力不是很強(qiáng)，洗滌后，轉(zhuǎn)化率大大降低。而用RNA飽和后的海泡石，轉(zhuǎn)化率幾乎沒有降低，這些結(jié)果說明，海泡石的作用是借助一種瞬間機(jī)械力，在細(xì)胞膜上擊出孔，借此外源 DNA隨即進(jìn)入細(xì)胞。這種開孔現(xiàn)象是可逆的，移開海泡石，細(xì)胞膜會自動修復(fù)，將開孔重新封閉。細(xì)胞的這一特性，可使一些細(xì)胞外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到復(fù)制或表達(dá)的目的。另外，由于對DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制理解的不同，導(dǎo)致操作方法有差異。Wilharm等根據(jù)他們提出的機(jī)制認(rèn)為，在涂平板前要經(jīng)過預(yù)干處理[6]。根據(jù)我們對該機(jī)制的理解，預(yù)干處理對提高DNA轉(zhuǎn)化率不利。不經(jīng)預(yù)干過程，用玻璃棒立即涂平板，轉(zhuǎn)化率較高。而對照組，隨著預(yù)干處理時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化率會逐漸降低 (圖2，樣品13~15)。

在重新了解這種基于礦石納米材料微生物轉(zhuǎn)化機(jī)制基礎(chǔ)上，我們對該轉(zhuǎn)化進(jìn)行了優(yōu)化：使用對數(shù)生長初期的細(xì)胞為宿主，細(xì)胞濃度 OD600在 10~20之間，海泡石的濃度為0.1%，不經(jīng)預(yù)干過程，不需要特定的緩沖液，持續(xù)涂平板時(shí)間在1 min以上，可以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化率，有時(shí)高于鈣轉(zhuǎn)。這些不同于最近的報(bào)道[6]，但我們的轉(zhuǎn)化方法變得更直接，轉(zhuǎn)化時(shí)間變得更短。由于我們使用轉(zhuǎn)化率較低的pET15b作為實(shí)驗(yàn)對象，說明這種方法可以用于多種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。使用其他質(zhì)粒如pUC18等可以得到大于1×106/μg質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA (質(zhì)粒)，線型DNA和其他微生物的轉(zhuǎn)化有待摸索。

當(dāng)然這種轉(zhuǎn)化方法與電轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化率還有很大差距，不同的人操作，會有較大的差異。但該方法無需感受態(tài)的制備、不需要貴重的儀器、甚至單菌落冷藏 1個(gè)月都可以直接實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，所以這種方法的簡便性會得到很多研究者的青睞。海泡石用于微生物的DNA轉(zhuǎn)化屬于一種非常新的轉(zhuǎn)化方法，而且提升的空間很高。在我們的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將DNA與E. coli DH5α在微型離心管內(nèi)混合，槍頭的隨機(jī)抽動就可以實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)化，該現(xiàn)象預(yù)示可以通過海泡石、DNA和微生物的共培養(yǎng)就可以實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)化，這為研究特種微生物的DNA轉(zhuǎn)化提供很新的方法。另外，海泡石可以用于革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化[1]。但該方法用于真核生物的DNA轉(zhuǎn)化還沒有報(bào)道，根據(jù)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化機(jī)制推理，這種方法應(yīng)該很快被用于真核生物的轉(zhuǎn)化。

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