微生物細(xì)胞工廠中多基因表達(dá)的控制策略

姜天翼，李理想，馬翠卿，許平

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 上海交通大學(xué) 微生物代謝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

細(xì)胞工廠的優(yōu)化

微生物細(xì)胞工廠中多基因表達(dá)的控制策略

姜天翼1，李理想1，馬翠卿1，許平2

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 上海交通大學(xué) 微生物代謝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

微生物代謝工程和合成生物學(xué)是當(dāng)今微生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，微生物的生長(zhǎng)速度快、容易進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)；遺傳背景清楚、遺傳操作簡(jiǎn)便可靠等性質(zhì)使其在與人類生活相關(guān)的多個(gè)領(lǐng)域中起到重要的作用。微生物細(xì)胞工廠是指人工設(shè)計(jì)的能夠進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的微生物代謝體系。許多微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建由于引入多個(gè)基因或整條代謝途徑，而可能導(dǎo)致代謝失衡、部分代謝中間產(chǎn)物積累等問題，需要使用一定的調(diào)控策略加以控制。以下對(duì)涉及多個(gè)基因作用的微生物細(xì)胞工廠中所使用的調(diào)控策略，分為若干層次進(jìn)行了總結(jié)和探討，并對(duì)今后多基因控制策略的發(fā)展方向進(jìn)行了預(yù)測(cè)與展望。

微生物細(xì)胞工廠，代謝工程，多基因表達(dá)，基因表達(dá)調(diào)控

Abstract:Microbial metabolic engineering and synthetic biology are important disciplines of microbial technology nowadays.Microbial cells are fast growing, easy to be cultivated in large scale, clear in genetic background and convenient in genetic modification. They play an important role in many domains. Microbial cell factory means an artificial microbial metabolic system that can be used in chemical production. The construction of a microbial cell factory needs transferring of multiple genes or a whole metabolic pathway, which may cause some problems such as metabolism imbalance and accumulation of mesostates. This review focuses on the regulation strategies of different levels involving simultaneous engagement of multiple genes. Future perspectives on the development of this domain were also discussed.

Keywords:microbial cell factory, metabolic engineering, expression of multiple genes, gene expression regulation

微生物是自然界中結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單、研究最為深入，而應(yīng)用潛力十分巨大的物種。人類利用微生物進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)具有悠久的歷史，其產(chǎn)物從傳統(tǒng)的酒、醋等食品已經(jīng)延伸到現(xiàn)在的燃料、醫(yī)藥、化工制品等與人類社會(huì)息息相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的微生物應(yīng)用方法為從自然界中按照一定的要求直接篩選，或再通過誘變方法得到目的菌株或菌群即加以應(yīng)用。然而由于微生物的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其自身所擁有的生產(chǎn)能力往往達(dá)不到較好的應(yīng)用效果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物代謝工程應(yīng)運(yùn)而生。1991年，Bailey JE將代謝工程定義為“采用重組DNA技術(shù)，操縱細(xì)胞的酶、運(yùn)輸及調(diào)節(jié)功能，達(dá)到提高或改善細(xì)胞活性的目的”[1]。代謝工程為微生物“細(xì)胞工廠”繪制出了重要的藍(lán)圖[2]，微生物細(xì)胞逐漸被開發(fā)為一種“可編程的”裝置 (‘Programmable’entities)，其改造方法由單一的過表達(dá)或失活某種酶發(fā)展成為新式的、由工程設(shè)計(jì)所導(dǎo)向的對(duì)細(xì)胞組件進(jìn)行整體規(guī)模上的改造，以及以簡(jiǎn)單的組件為基礎(chǔ)構(gòu)建精細(xì)的代謝系統(tǒng)[3]。因此，在現(xiàn)代的細(xì)胞工廠構(gòu)建工程中，往往要引入多個(gè)基因甚至整套的代謝途徑，并要使其在宿主中最大化行使其功能。通過代謝工程構(gòu)建含多個(gè)外源基因的微生物細(xì)胞工廠已被應(yīng)用在多種物質(zhì)的生產(chǎn)中，如萜類化合物[4-5]、聚酮類化合物[6-8]、生物塑料制品[9]、非核糖體多肽[10]、聚合物模塊[11]等。

1 重組代謝途徑中多基因表達(dá)所存在的問題

雖然在微生物中構(gòu)建含有外源合成途徑的細(xì)胞工廠以生產(chǎn)復(fù)雜化合物及醫(yī)藥制品是一種替代化學(xué)合成方法的理想途徑，但這一方法還是存在著重大的缺陷：即在將較復(fù)雜的代謝途徑轉(zhuǎn)移的過程中，其原本的代謝流調(diào)控機(jī)制往往無(wú)法再發(fā)揮作用[5]。自然的代謝調(diào)控是一系列十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪^程 (如正、負(fù)反饋調(diào)節(jié))，在進(jìn)化過程中往往會(huì)形成某種代謝物“恰到好處”的合成方式 (‘Just enough’synthesis)。然而，人工構(gòu)建合成途徑的代謝流量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過自然代謝途徑的代謝流量，過高的外源表達(dá)會(huì)與宿主本身的代謝過程競(jìng)爭(zhēng)包括核苷酸、氨基酸在內(nèi)的各種資源，這些資源可能是宿主用于自身的增殖，甚至是目的產(chǎn)物的合成[12]。同時(shí)，過高的外源表達(dá)量會(huì)誘發(fā)宿主的一系列反應(yīng)，例如壓力反應(yīng) (Stress response)、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng) (Stringent response)、熱激反應(yīng)(Heat shock response)等[13-15]，這些反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致多種特殊基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞正常蛋白的合成，質(zhì)粒不穩(wěn)定、細(xì)胞的裂解和細(xì)胞遺傳信息的改變，并最終會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的細(xì)胞工廠無(wú)法按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方式進(jìn)行工作[16]。另一方面，引入外源代謝途徑雖然能夠移除某些限制代謝流量的調(diào)控位點(diǎn)，但其中各步酶反應(yīng)的代謝流量難以保持平衡，這種失衡也是影響總體生產(chǎn)能力的重要制約因素。某些中間代謝物，尤其是細(xì)胞毒性物質(zhì)的大量積累會(huì)嚴(yán)重影響宿主細(xì)胞正常的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)效率的下降[17]。為了避免上述一系列情況的發(fā)生，在細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，對(duì)外源代謝途徑的總體流量以及各個(gè)酶反應(yīng)效率的平衡加以有效地控制是十分重要的。當(dāng)代的代謝工程研究已經(jīng)為協(xié)調(diào)多基因表達(dá)提供了多個(gè)層次的策略，包括轉(zhuǎn)錄水平的控制、翻譯水平的控制、以及使用一些特殊的附加裝置進(jìn)行控制等[3,12]。

2 控制多基因表達(dá)的策略

2.1 針對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄過程的控制策略

對(duì)轉(zhuǎn)錄過程的控制方法主要集中在對(duì)于啟動(dòng)子的研究方面。協(xié)調(diào)多個(gè)外源基因表達(dá)最簡(jiǎn)單、最直接的途徑是對(duì)不同的基因使用不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如使用Plac啟動(dòng)子控制第 1個(gè)基因的表達(dá)，而用PBAD啟動(dòng)子控制第2個(gè)基因的表達(dá)。Van Dien SJ等通過在大腸桿菌宿主中分別使用Ptac啟動(dòng)子和PBAD啟動(dòng)子控制編碼多磷酸鹽激酶 (PPK) 的基因和編碼多磷酸鹽酯酶 (PPX) 的基因，能夠在不同的培養(yǎng)時(shí)期添加相應(yīng)的誘導(dǎo)劑分別啟動(dòng) 2個(gè)基因的表達(dá)。通過這一控制方法，該課題組對(duì)于微生物中磷酸鹽和能量的儲(chǔ)存以及多聚磷酸鹽的作用進(jìn)行了深入的研究[18-19]。利用多個(gè)啟動(dòng)子的方法雖然設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，但是具有嚴(yán)重缺陷：首先，反應(yīng)體系需要添加多種誘導(dǎo)劑，在代謝途徑中設(shè)計(jì)的環(huán)節(jié)較多時(shí)，不可避免地會(huì)使用到價(jià)格昂貴的物質(zhì)，大大增加了生產(chǎn)成本；第二，較多的誘導(dǎo)劑添加過程會(huì)增加反應(yīng)過程的復(fù)雜性，從而降低細(xì)胞工廠體系生產(chǎn)中的穩(wěn)定性；第三，多種誘導(dǎo)劑的添加可能會(huì)引起交互作用 (Cross-talk)，限制了許多啟動(dòng)子組合的應(yīng)用[20-21]。

基于上述缺點(diǎn)，研究者希望能夠通過一種誘導(dǎo)物質(zhì)同時(shí)誘導(dǎo)多個(gè)基因以不同的強(qiáng)度表達(dá)，最先被考慮到的方法是對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造。多種方法被應(yīng)用于對(duì)啟動(dòng)子的篩選及人工改造。構(gòu)建啟動(dòng)子庫(kù)是一種獲得多種使用相同誘導(dǎo)劑而強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子的有效方法，該方法也可被稱為“啟動(dòng)子工程”，其理論基礎(chǔ)是保持調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)序列不變，通過改變啟動(dòng)子?10區(qū)和?35區(qū)的保守序列或者其間的若干個(gè)堿基，可將啟動(dòng)子的強(qiáng)度調(diào)整至不同的水平[16]。Nevoigt等使用隨機(jī)突變構(gòu)建出一個(gè)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的DAN1啟動(dòng)子庫(kù)，并使用多級(jí)流式細(xì)胞術(shù)篩選出溶氧敏感性的啟動(dòng)子，細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中對(duì)氧氣的消耗即可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的啟動(dòng)[22]。對(duì)于啟動(dòng)子?10和?35保守區(qū)堿基的突變會(huì)使啟動(dòng)子的強(qiáng)度發(fā)生較大的變化，而對(duì)兩者之間堿基進(jìn)行突變對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的影響較小，適合于更加精細(xì)的對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造[23]。Jensen等通過保持保守序列不變，而隨機(jī)突變之間的分隔區(qū)域，構(gòu)建了乳酸乳球菌Lactococcus lactis中的啟動(dòng)子庫(kù)，篩選得到了38個(gè)突變的啟動(dòng)子，其啟動(dòng)強(qiáng)度從0.3個(gè)單位到 2 000個(gè)單位不等。更值得注意的是，所獲得啟動(dòng)子強(qiáng)度的增強(qiáng)并非跳躍式的，而是逐步升高[24]。通過構(gòu)建這一類啟動(dòng)子庫(kù)，可以選擇合適的啟動(dòng)子對(duì)不同蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行更加精細(xì)的控制，這對(duì)細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)將會(huì)起到重要的幫助作用。構(gòu)建啟動(dòng)子庫(kù)的方法可以使細(xì)胞工廠體系中所有的基因由同一種誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，并且不用顧及誘導(dǎo)劑的加量而使各個(gè)基因按照合適的水平進(jìn)行表達(dá)。但是其構(gòu)建的過程往往較為困難，并且對(duì)于一條代謝途徑進(jìn)行控制時(shí)，必須首先對(duì)各個(gè)步驟酶的活性進(jìn)行復(fù)雜的優(yōu)化以確定選用何種強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行控制[20]。

除了針對(duì)啟動(dòng)子的選擇和改造以外，還有其他的方法可以對(duì)轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行控制。Khlebnikov 等通過添加可以獨(dú)立地對(duì)于誘導(dǎo)劑的運(yùn)輸進(jìn)行控制的基因，限制誘導(dǎo)劑進(jìn)入細(xì)胞的過程，構(gòu)建了一套阿拉伯糖誘導(dǎo)的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)[25]。使用外源的RNA聚合酶或者轉(zhuǎn)錄因子，同樣可以在單個(gè)細(xì)胞的水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行控制[20]。微生物基因組中的σ因子是RNA聚合酶的亞基之一，其變化可以改變啟動(dòng)子對(duì)于RNA聚合酶的選擇性，影響轉(zhuǎn)錄水平，從而可以對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行總體水平上的控制[26-28]。Stephanopoulos課題組通過隨機(jī)突變大腸桿菌中的σ70因子，同時(shí)改變了多個(gè)基因的調(diào)控并進(jìn)行優(yōu)化，增加了外源構(gòu)建的番茄紅素生產(chǎn)途徑的代謝產(chǎn)量及宿主的抗逆性[29]。

2.2 針對(duì)mRNA翻譯過程的控制策略

傳統(tǒng)的在翻譯水平對(duì)于基因表達(dá)的控制是由突變核糖體結(jié)合位點(diǎn)以增強(qiáng)或減弱翻譯起始的水平實(shí)現(xiàn)的，而現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出更加先進(jìn)的方法，包括使用人工的核酶、核糖開關(guān) (Riboswitch) 等感應(yīng)組件、人工構(gòu)建操縱子并改變操縱子基因間序列(Intergenic region)、構(gòu)建基因間序列庫(kù)等。

生物體中的許多mRNA含有一種稱為核糖開關(guān)的調(diào)控裝置，該裝置是一類具有復(fù)雜折疊結(jié)構(gòu)的RNA 結(jié)構(gòu)域，位于 mRNA 的 5′非翻譯區(qū) (5′Untranslated regions, 5′UTRs)，在其寡核苷酸適配子部分 (Aptamers) 與特定的小分子物質(zhì)結(jié)合的情況下，通過使mRNA發(fā)生某些結(jié)構(gòu)變化而影響mRNA翻譯的起始、延伸等過程，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平[30]。相對(duì)于在特定蛋白的幫助下與mRNA結(jié)合的小RNA (MicroRNAs, miRNAs) 和干擾RNA (Short interfering RNAs, siRNAs) 調(diào)控方式，每一個(gè)核糖開關(guān)與一種特定的簡(jiǎn)單物質(zhì) (抗生素、代謝產(chǎn)物等) 相應(yīng)的結(jié)合即可行使其功能，而不需要輔助蛋白質(zhì)參與這一調(diào)節(jié)過程[31]。并且，如果通過體外人工篩選獲得可識(shí)別細(xì)胞代謝物的適配子[32]，則可設(shè)計(jì)出根據(jù)細(xì)胞自身的代謝狀況調(diào)節(jié)基因表達(dá)的系統(tǒng)，故核糖開關(guān)被認(rèn)為能夠比啟動(dòng)子更精確地調(diào)節(jié)基因表達(dá)和優(yōu)化代謝途徑[16]。在細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)方案中，可以通過添加人工構(gòu)建的核糖開關(guān)對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行控制。人工構(gòu)建的核糖開關(guān)主要有通過插入適配子進(jìn)行調(diào)控，通過促使 RNA螺旋移動(dòng)的方式進(jìn)行調(diào)控，通過反義RNA進(jìn)行調(diào)控等幾種方式[31]。其中，人工選擇合適適配子插入mRNA的調(diào)控方法只有在真核細(xì)胞中的應(yīng)用報(bào)道，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞[33]、酵母[34-35]等，而在微生物中難以加以應(yīng)用。這是因?yàn)椴迦氲倪m配子只有位于核糖體結(jié)合區(qū)域和翻譯起始密碼子之間才能發(fā)揮作用，而原核生物的核糖體結(jié)合位點(diǎn) (SD序列) 與起始密碼子在空間上是緊密偶聯(lián)的，兩者之間的距離不能超過13個(gè)核苷酸。除非能夠篩選出新型的適配子，一般意義上的適配子無(wú)法插入到這么短的一段距離內(nèi)[31]。利用RNA螺旋移動(dòng)的方式進(jìn)行調(diào)控是一種原核細(xì)胞適用的調(diào)控策略，即在目標(biāo)mRNA的SD序列之前添加含雙結(jié)構(gòu)域的元件，阻礙核糖體小亞基與 SD序列結(jié)合，當(dāng)特定配體與適配子結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，會(huì)造成另一個(gè)結(jié)構(gòu)域——橋狀結(jié)構(gòu)域發(fā)生滑動(dòng)，使該元件整體遠(yuǎn)離SD序列，核糖體得以結(jié)合上去，從而使翻譯起始[36]。反義RNA調(diào)控同樣可以在微生物中加以應(yīng)用，其方式是通過一小段人工插入的 RNA序列 1與原始mRNA的 SD序列形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙核糖體的結(jié)合，而通過另一小段額外轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA序列2高特異性地結(jié)合RNA序列1，可以解除其與SD序列的結(jié)合，頸環(huán)結(jié)構(gòu)消失，翻譯得以起始[37]。在細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)中，合理地加入不同類型的核糖開關(guān)組件，可以達(dá)到控制多個(gè)基因的差異水平表達(dá)的效果，甚至是與細(xì)胞代謝情況密切相關(guān)的表達(dá)控制。

在微生物中，多亞基蛋白或是一條代謝途徑中的多個(gè)酶通常位于一個(gè)由單個(gè)啟動(dòng)子控制的操縱子中，而操縱子通過某些機(jī)制改變轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性或者翻譯起始能力，以協(xié)調(diào)這些基因的表達(dá)水平。這種調(diào)控方式為在mRNA水平上人工控制多基因差異水平表達(dá)提供了另一種思路，即將多個(gè)基因構(gòu)建在一個(gè)操縱子中，再對(duì)操縱子中基因間的序列進(jìn)行改造，引入mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者RNA酶作用位點(diǎn)等調(diào)整mRNA的性質(zhì)，從而影響基因的表達(dá)水平。該種方法可以在使用一個(gè)啟動(dòng)子、一種誘導(dǎo)劑的作用下實(shí)現(xiàn)多種蛋白的差異水平表達(dá)。Keasling課題組對(duì)這種控制策略進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。該課題組在大腸桿菌宿主中嘗試使用經(jīng)過系統(tǒng)設(shè)計(jì)的操縱子基因間序列進(jìn)行調(diào)控，將編碼綠色熒光蛋白的gfp基因和編碼半乳糖苷酶N端的lacZ基因依次置于一個(gè)操縱子中，而將兩段編碼區(qū)中間設(shè)計(jì)一段特殊的序列，在初始mRNA上5′端至3′端依次結(jié)構(gòu)為：gfp基因-發(fā)夾結(jié)構(gòu)-RNA 酶 E酶切位點(diǎn)-發(fā)夾結(jié)構(gòu)-lacZ基因-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其加工過程中該段序列會(huì)被RNA酶剪切為兩段單獨(dú)的 mRNA，而通過加入的發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響兩段 mRNA各自的穩(wěn)定性，使用不同的RNA酶E酶切位點(diǎn)以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可以將2種酶的酶活控制在不同的比例[38]。如果將2個(gè)編碼基因gfp和lacZ的位置互換，同時(shí)分別使用上述控制策略，能夠使兩者的酶活相差更大[39]。然而，上述方法也存在著缺陷。首先，同啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑一樣，多種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控元件會(huì)有交互作用，如mRNA降解影響轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄狀況的變化又有可能加速mRNA的降解[40]；其次，上述方法只能將2個(gè)基因的相對(duì)活性控制在少數(shù)幾個(gè)固定的水平，因此在實(shí)際的代謝途徑構(gòu)建中難以設(shè)計(jì)出能將相對(duì)比例控制在合適水平的組件。為了克服這些缺陷，該課題組構(gòu)建了一個(gè)可調(diào)節(jié)基因間序列 (Tunable intergenic regions, TIGRs) 庫(kù)，通過PCR將4組寡核苷酸序列隨機(jī)組合，得到了 104個(gè)基因間序列，這些序列包括不同mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、RNA酶剪切位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)抑制序列等的組合。再經(jīng)過轉(zhuǎn)化子篩選，得到的可調(diào)節(jié)基因間序列庫(kù)可以將2個(gè)基因編碼蛋白的活性比例在1∶1到1∶100的范圍內(nèi)改變。通過選擇合適的序列，他們優(yōu)化了在大腸桿菌中構(gòu)建的甲羥戊酸合成途徑，并成功地將其產(chǎn)量提高了7 倍[41]。

2.3 應(yīng)用支架蛋白質(zhì)的控制策略

在細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，相比于基因水平上的改造，在蛋白質(zhì)層次上對(duì)于代謝途徑的平衡和控制較為困難，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的定向進(jìn)化或修飾是一項(xiàng)相當(dāng)復(fù)雜的工作，雖然具有理論上的可能性，比如通過改造調(diào)整代謝關(guān)鍵步驟酶的酶活，使構(gòu)建的代謝途徑達(dá)到平衡，但其實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、操作都具有較高的難度。而另一種針對(duì)蛋白質(zhì)的特殊調(diào)控策略研究正在逐漸開展起來(lái)，即使用人工合成的支架蛋白質(zhì) (Scaffold proteins) 對(duì)代謝途徑中的各個(gè)組件進(jìn)行模塊化的控制 (Modular control)。支架蛋白本身是一種存在于生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的輔助蛋白，在空間上將該系統(tǒng)中的多個(gè)蛋白組織到一起，形成一個(gè)復(fù)合物[42-43]。Bashor等報(bào)道了使用酵母中改造的Ste5支架蛋白對(duì)酵母接合MAP激酶途徑進(jìn)行調(diào)整，在自然狀態(tài)下，酵母中的Ste5支架蛋白將3個(gè)接合MAP激酶途徑中的蛋白整合在一起，而該工作在Ste5上額外添加了一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)合位點(diǎn)，再通過添加裝有酸性亮氨酸拉鏈的正/負(fù)調(diào)節(jié)劑(Modulators)，即可以將該途徑的代謝通量上調(diào)或者下調(diào)[44]。自然存在的支架蛋白質(zhì)只限應(yīng)用于其固有的信號(hào)途徑中，相應(yīng)的改造同樣應(yīng)用十分局限，但以其原理為基礎(chǔ)，也可以構(gòu)建出完全根據(jù)需要而人工設(shè)計(jì)的支架蛋白質(zhì)原件。Keasling課題組在該領(lǐng)域同樣有突出的貢獻(xiàn)，他們針對(duì)在大腸桿菌中構(gòu)建的甲羥戊酸代謝途徑設(shè)計(jì)了一個(gè)支架蛋白組件，該蛋白由3個(gè)不同的配基組成，而在該代謝途徑的3個(gè)酶上各添加一個(gè)相應(yīng)的配體，通過該支架的作用，可以將 3個(gè)酶同時(shí)固定在一個(gè)復(fù)合物中。如果將支架蛋白質(zhì)的 3個(gè)配基設(shè)定為不同的數(shù)量，則可以在同一支架上固定不同數(shù)量的 3種酶，以此可以調(diào)整 3個(gè)酶的數(shù)量的比值。該設(shè)計(jì)方案不僅可以優(yōu)化代謝途徑中多個(gè)酶的化學(xué)計(jì)量數(shù)比，平衡途徑中各個(gè)環(huán)節(jié)的流量，還可以縮短各個(gè)酶之間的空間距離，起到“底物通道”(Substrate channeling) 的效果，使中間代謝產(chǎn)物傳遞距離更短，與細(xì)胞環(huán)境的接觸更少而避免擴(kuò)散和降解。在這些特點(diǎn)共同的作用下，甲羥戊酸的產(chǎn)量成功地提高了 77倍[12]。人工設(shè)計(jì)的支架蛋白質(zhì)對(duì)于多基因表達(dá)的控制雖然精密、高效、應(yīng)用范圍廣，但是其設(shè)計(jì)和實(shí)施同樣較為復(fù)雜，實(shí)施的難度較高，目前類似的工作報(bào)道很少。

圖1 微生物細(xì)胞工廠中多基因表達(dá)調(diào)控方式總覽[12,20]Fig.1 Overview of the regulation strategies for multiple genes expression in microbial cell factory[12,20].

3 結(jié)論與展望

微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)是精細(xì)而復(fù)雜的，然而隨著代謝工程、合成生物學(xué)等相關(guān)研究工作的不斷深入，已經(jīng)為這項(xiàng)工作提供了越來(lái)越多的服務(wù)平臺(tái)。各種文庫(kù)如啟動(dòng)子文庫(kù)、核糖開關(guān)文庫(kù)、基因間序列文庫(kù)等的構(gòu)建極大地方便了對(duì)于多基因的控制，設(shè)計(jì)者只需要選擇合適的元件組合到目標(biāo)外源代謝途徑中，即可以平衡各個(gè)基因的表達(dá)水平，甚至精確地控制各個(gè)酶數(shù)量和活性的相對(duì)值。目前，研究者進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，除了自身的平衡問題以外，一條外源代謝途徑的植入會(huì)在代謝網(wǎng)絡(luò)的層次上對(duì)宿主菌株產(chǎn)生許多干擾[45]，而以生物信息學(xué)、基因芯片技術(shù)、功能基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等為輔助，解決工程菌株整體代謝網(wǎng)絡(luò)中存在的問題，構(gòu)建更加高效和復(fù)雜的細(xì)胞工廠系統(tǒng)已經(jīng)成為研究的新熱點(diǎn)，對(duì)于多基因代謝途徑控制的研究已逐漸從模塊化的組件水平上升至完整的系統(tǒng)水平。計(jì)算機(jī)輔助工具以及專用代謝模擬工具的出現(xiàn)和完善將會(huì)進(jìn)一步為含有多個(gè)外源基因細(xì)胞工廠體系的設(shè)計(jì)提供強(qiáng)有力的支持，但是相關(guān)的開發(fā)工作仍處于起步階段，并且難度較大。因?yàn)槲⑸锛?xì)胞即使相對(duì)于自然界中其他的生命體系較為簡(jiǎn)單，其對(duì)于計(jì)算機(jī)編程來(lái)說(shuō)仍然還是一個(gè)十分復(fù)雜的系統(tǒng)。一個(gè)可行的方向是構(gòu)建只含有最小基因組(Minimal genome)[46]的宿主菌株，最大程度地減少宿主本身代謝的復(fù)雜性，簡(jiǎn)化計(jì)算機(jī)模擬程序的設(shè)計(jì)。相信在不久的將來(lái)，將有越來(lái)越多設(shè)計(jì)精密、含有更多更復(fù)雜的基因而控制又更加方便的細(xì)胞工廠系統(tǒng)，能夠?yàn)槿祟惿鐣?huì)作出巨大的貢獻(xiàn)。

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Strategies for regulating multiple genes in microbial cell factories

Tianyi Jiang1, Lixiang Li1, Cuiqing Ma1, and Ping Xu2

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2MOE Key Laboratory of Microbial Metabolism,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200240,China

Received:May 24, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30770064), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2007CB707803).

Corresponding author:Cuiqing Ma. Tel: +86-531-88364003; Fax: +86-531-88369463; E-mail: macq@sdu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30770064)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707803) 資助。