微膠囊固定化混合菌群發(fā)酵產(chǎn)氫
——構(gòu)建一種虛擬“細(xì)胞工廠”的嘗試

馬茜嵐，林東強(qiáng)，姚善涇

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，杭州 310027

細(xì)胞工廠的優(yōu)化

微膠囊固定化混合菌群發(fā)酵產(chǎn)氫
——構(gòu)建一種虛擬“細(xì)胞工廠”的嘗試

馬茜嵐，林東強(qiáng)，姚善涇

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，杭州 310027

采用硫酸纖維素鈉 (NaCS)/聚二甲基二烯丙基氯化銨 (PDMDAAC) 微膠囊體系，固定混合產(chǎn)氫菌群，構(gòu)建成一個(gè)能高效產(chǎn)氫的虛擬“細(xì)胞工廠”。經(jīng)過(guò)菌群活化預(yù)處理，激活了產(chǎn)氫活力，進(jìn)一步通過(guò)NaCS/PDMDAAC微膠囊固定化，形成適宜的內(nèi)部微環(huán)境，有效增強(qiáng)了菌群對(duì)溫度的適應(yīng)能力，提高了底物濃度，氫氣產(chǎn)量比游離細(xì)胞增長(zhǎng)30%以上，菌體濃度提高2倍到3.2 g/L。連續(xù)15批培養(yǎng)，囊內(nèi)菌體濃度顯著提高，發(fā)酵時(shí)間縮短，氫氣產(chǎn)率保持在1.73～1.81 mol H2/mol glucose，平均產(chǎn)氫速率提高了198.6%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中有較高比例的丁酸和乙酸，由此可以使該虛擬“細(xì)胞工廠”成為一個(gè)多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)體系。

生物制氫，NaCS/PDMDAAC微膠囊，固定化細(xì)胞，虛擬“細(xì)胞工廠”

Abstract:Sodium cellulose sulfate (NaCS)/Ploy-dimethyl-dially-ammonium-chloride (PDMDAAC) microcapsules were used as a novel pseudo “Cell Factory” to immobilize mixed bacteria for hydrogen production under anaerobic conditions. Compared to free cells, the hydrogen production was increased more than 30% with NaCS/PDMDAAC microcapsules as the pseudo “Cell Factory”.The biomass was increased from 1.5 g/L in free cell culture to 3.2 g/L in the pseudo “Cell Factory”. This pseudo “Cell Factory”system showed the excellent stability during 15 repeated-batches. The hydrogen yield maintained 1.73?1.81 mol H2/mol glucose. The fermentation cycle was shortened from 48 h to 24 h, resulting in an increase of 198.6% in the hydrogen production rate. There were high percentage of butyric acid and acetic acid in the culture broth, which meant that the pseudo “Cell Factory” established in the present work could be used for the multi-product system.

Keywords:hydrogen, NaCS/PDMDAAC microcapsule, immobilized cells, pseudo “Cell Factory”

氫能作為一種清潔能源受到人們的普遍關(guān)注[1-4]，生物制氫則是生物煉制的一個(gè)重要內(nèi)容，目前主要有光發(fā)酵[5-6]和暗發(fā)酵[7-8]。暗發(fā)酵表現(xiàn)出顯著的優(yōu)越性[9]：菌種產(chǎn)氫能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快；發(fā)酵過(guò)程無(wú)需光源，不受光照條件制約；可利用不同底物，原料來(lái)源廣、價(jià)格低廉，并可以協(xié)同治理環(huán)境污染[10-11]。從工業(yè)化角度來(lái)看，混合菌群發(fā)酵比純菌種發(fā)酵培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，操作方便，且可以利用不同菌群的協(xié)同效應(yīng)擴(kuò)大底物范圍、提高產(chǎn)氫效率[12]，但混合菌群發(fā)酵的復(fù)雜程度顯著增加，研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

目前暗發(fā)酵研究主要基于游離細(xì)胞，但游離細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)常由于高稀釋率而導(dǎo)致細(xì)胞溢出，采用固定化培養(yǎng)是較好的方法，可保持高菌體濃度，降低操作成本。固定化體系本身易于產(chǎn)生厭氧環(huán)境，非常適用于對(duì)氧氣敏感的暗發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌。在眾多固定化體系中，微膠囊固定化倍受關(guān)注，一層微囊外膜包裹著合適的液體環(huán)境，內(nèi)部各種細(xì)胞協(xié)調(diào)生長(zhǎng)和代謝，實(shí)現(xiàn)各種生化反應(yīng)，外膜承擔(dān)著隔離、保護(hù)和物質(zhì)傳遞的功能。因此，微膠囊體系就像一個(gè)虛擬的“細(xì)胞工廠”，從外界吸收營(yíng)養(yǎng)成分，通過(guò)內(nèi)部復(fù)雜的代謝反應(yīng)，合成特殊產(chǎn)物，最后排放到膜外。硫酸纖維素鈉 (Sodium cellulose sulfate，NaCS)/聚二甲基二烯丙基氯化銨 (Ploy-dimethyldially-ammonium-chloride，PDMDAAC) 微膠囊體系具有生物相容性好、制備方法簡(jiǎn)單、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好等優(yōu)點(diǎn)[13-15]，前期曾采用該體系進(jìn)行了多種細(xì)胞固定化培養(yǎng)研究[16-21]，產(chǎn)物包括乙醇、乳酸、谷氨酸、1,3-丙二醇、蘇云金桿菌、溶栓酶等，發(fā)現(xiàn)該體系尤其適用于厭氧培養(yǎng)。以上工作均為單菌體系，應(yīng)用于混菌固定化，構(gòu)建虛擬“細(xì)胞工廠”將是新的突破。

因此，本文將嘗試采用NaCS/PDMDAAC微膠囊體系來(lái)固定化混合產(chǎn)氫菌群，構(gòu)建虛擬的“細(xì)胞工廠”，利用不同菌群的協(xié)同作用，提高產(chǎn)氫性能。作為探索研究，將主要考察菌群改造方法、搖瓶條件下混合菌群的產(chǎn)氫特性，探討微膠囊固定化混菌“細(xì)胞工廠”以及連續(xù)產(chǎn)氫的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

混合產(chǎn)氫菌群富集自厭氧活性污泥，厭氧活性污泥取自杭州市四堡污水處理廠的初級(jí)厭氧消化池。NaCS的制備參照文獻(xiàn)[22]。PDMDAAC，Mw=200 000～300 000。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨4；牛肉膏2；酵母汁 1；NaCl 2；MgCl20.1；FeSO4·7H2O 0.1；L-半胱氨酸0.5；K2HPO41.5；葡萄糖為碳源，除了考察葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)氫影響的部分實(shí)驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度均為20。添加維生素液 10 mL/L，微量元素液 10 mL/L。調(diào)節(jié)pH值為7，121℃滅菌20 min。

維生素液 (g/L)：谷氨酸0.01；抗壞血酸0.025；核黃素0.025；檸檬酸0.02；葉酸0.01；對(duì)氨基苯甲酸0.01；肌酸0.025；吡多醛鹽酸鹽0.05。

微 量 元 素 液 (g/L)： MnSO4·7H2O 0.01 ；ZnSO4·7H2O 0.05；H3BO30.01；CaCl2·2H2O 0.01；NaMnO40.01；CoCl2·6H2O 0.2；KAl(SO4)20.01。

1.2 產(chǎn)氫菌群的活化預(yù)處理

首先對(duì)厭氧活性污泥進(jìn)行了高溫預(yù)處理，蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃高溫加熱8 min，自然冷卻至室溫。取高溫處理的污泥10 mL于300 mL可密封搖瓶中，添加100 mL培養(yǎng)基，37℃、100 r/min厭氧培養(yǎng)。48 h后，取10 mL發(fā)酵液作為種子液，其余條件同上，進(jìn)行第2批次培養(yǎng)。以此類推，連續(xù)5批進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，富集產(chǎn)氫菌群。

1.3 微膠囊固定化

發(fā)酵菌群的微膠囊化在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，具體操作如下：取預(yù)培養(yǎng)后的菌液 20 mL，菌體濃度約0.5 g/L，用無(wú)菌水稀釋至100 mL，添加NaCS配置成 4% (W/V) 的 NaCS溶液；PDMDAAC配制成8% (W/V) 溶液；用注射器針頭將配好的含菌NaCS溶液逐滴滴至攪拌中的PDMDAAC溶液，繼續(xù)溫和攪拌；反應(yīng)約30 min，收集制備好的微膠囊，用無(wú)菌水充分洗去微膠囊表面殘余的PDMDAAC，即得到包埋了發(fā)酵產(chǎn)氫菌的NaCS/PDMDAAC微膠囊，平均直徑為2.8 mm。

1.4 培養(yǎng)方法

單批次發(fā)酵：300 mL可密封搖瓶中添加100 mL培養(yǎng)基，接種50 mL包埋了發(fā)酵產(chǎn)氫菌的微膠囊或10 mL含有等量產(chǎn)氫菌的種子液，通氮?dú)? min排盡空氣后，接氫氣收集器，封閉體系，以排水法收集發(fā)酵氣體。一般情況下，40℃、120 r/min厭氧培養(yǎng)48 h。考察溫度對(duì)固定化和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力影響時(shí)，搖瓶發(fā)酵分別在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃六個(gè)溫度下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，氣體體積、組成和液相產(chǎn)物成分根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求定期測(cè)定。

多批次發(fā)酵：第1批發(fā)酵結(jié)束后，將搖瓶中的發(fā)酵液倒出，保留NaCS/PDMDAAC微膠囊，并添加100 mL新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行下一批發(fā)酵，其余操作同單批次發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵15批。

1.5 分析方法

氫氣含量：發(fā)酵產(chǎn)生氣體收集于氫氣收集器中，讀取氣體體積后矯正為25℃和1 atm時(shí)氣體體積。從取樣口取氣相樣品檢測(cè)氫氣濃度，使用福立9790氣相色譜儀檢測(cè)，柱長(zhǎng) 4 m，填料為 5A分子篩+GDX-50，熱導(dǎo)池檢測(cè)器，高純氮?dú)庾鬏d氣，流速為40 mL/min，柱溫40℃，熱導(dǎo)池和進(jìn)樣器溫度為80℃，進(jìn)樣量 1 000 μL。

可溶性發(fā)酵產(chǎn)物：使用安捷倫6820氣相色譜儀檢測(cè)，色譜柱型號(hào)HP-Innowax 19091N-213 30 m×0.32 mm，氫火焰檢測(cè)器，高純氮?dú)庾鬏d氣，柱流量3 mL/min，分流比 50，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250℃，進(jìn)樣量 0.4 μL。柱升溫程序：50℃保持 3 min，15℃/min升溫至200℃，200℃保持2 min。

葡萄糖含量：用DNS法測(cè)定。

菌體濃度：取20個(gè)微膠囊，破碎，沉降去除并洗滌微膠囊碎片，將釋放的內(nèi)容物適量稀釋，用紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光值，用單位體積發(fā)酵液干重和吸光度值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算得到菌體濃度。

pH值：Thermo Orion pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氫菌群的富集和活化

在我們前期工作中[23]，已經(jīng)采用熱處理、酸處理和堿處理等方法，對(duì)初始的活性污泥進(jìn)行了產(chǎn)氫菌群的富集。經(jīng)平板培養(yǎng)和鏡檢，不同處理方法得到的菌群很相似。隨機(jī)選取10個(gè)菌落進(jìn)行16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)序列完全相同。通過(guò)NCBI的blastN序列比對(duì)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與腸桿菌屬Enterobacter的序列同源性為 99%以上。文獻(xiàn)報(bào)道的許多產(chǎn)氫微生物是梭菌屬Clostridia，這可能與本文活性污泥來(lái)源和預(yù)處理方法有關(guān)。由此說(shuō)明，本文富集的菌群是以腸桿菌屬為主的新產(chǎn)氫菌群，在我們的前期工作中已有詳細(xì)的說(shuō)明[23]。

經(jīng)檢測(cè)，厭氧活性污泥經(jīng)高溫處理后發(fā)酵氣體中只含有氫氣和二氧化碳，沒(méi)有檢測(cè)到甲烷，說(shuō)明高溫處理比較有效，已去除了污泥中的產(chǎn)甲烷菌[23]。

2.2 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力的比較

圖1和圖2比較了游離細(xì)胞和微膠囊固定細(xì)胞的氫氣產(chǎn)量和菌體濃度隨時(shí)間的變化曲線。前期研究表明，營(yíng)養(yǎng)成分可以有效進(jìn)入微膠囊內(nèi)，氫氣可以排出囊外。微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度良好，培養(yǎng)過(guò)程未發(fā)現(xiàn)菌體泄漏。由圖 1可知，游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞都在培養(yǎng)8 h左右開(kāi)始產(chǎn)生氫氣，前32 h氫氣產(chǎn)量的變化曲線非常相似，然而游離細(xì)胞在 32 h后產(chǎn)氫變緩，固定化細(xì)胞則持續(xù)產(chǎn)氫直至發(fā)酵結(jié)束，微膠囊固定化后氫氣產(chǎn)量比游離細(xì)胞增長(zhǎng)了30.3%。將產(chǎn)氫速率定義為氫氣產(chǎn)量變化曲線的斜率，則固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的最大產(chǎn)氫速率分別11.32 mL/h和10.86 mL/h，固定化細(xì)胞略高于游離細(xì)胞。結(jié)果表明，微膠囊構(gòu)成的虛擬“細(xì)胞工廠”內(nèi)，具有合適的微環(huán)境，各種產(chǎn)氫菌群的協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，提高了產(chǎn)氫活力，延長(zhǎng)了產(chǎn)氫時(shí)間。從圖2的菌體濃度變化曲線可以看出，微囊化固定后的菌體濃度高達(dá)3.2 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離培養(yǎng)時(shí)的1.5 g/L。

圖1 固定化和游離細(xì)胞氫氣產(chǎn)量的變化曲線Fig.1 Time course of hydrogen evolution by immobilized and free cells.

2.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

圖3是不同培養(yǎng)溫度條件下固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率。在 25℃～37℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率都逐步提高。從 37℃～45℃，游離細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率隨著溫度的進(jìn)一步提高而迅速下降，而固定化細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率在40℃時(shí)達(dá)到最大值1.45 mol H2/mol glucose。不同培養(yǎng)溫度下，固定化細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率均高于游離細(xì)胞，尤其在40℃和45℃，固定化細(xì)胞的氫氣產(chǎn)率比游離細(xì)胞分別提高了29.5%和103.6%。

圖2 固定化和游離細(xì)胞菌體濃度的變化曲線Fig.2 Time course of biomass by immobilized and free cells.

表1列出了不同溫度下固定化和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力的比較。由表中數(shù)據(jù)可知，在發(fā)酵過(guò)程中，氫氣含量始終在 40%～50%之間。氫氣產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)率的變化規(guī)律一致，隨著溫度升高而逐漸增長(zhǎng)，游離細(xì)胞在37℃時(shí)達(dá)到最大值，而固定化細(xì)胞在40℃時(shí)達(dá)到最大值，可見(jiàn)固定化后菌群的耐受溫度有所提高。因此，微膠囊構(gòu)成的虛擬“細(xì)胞工廠”可適應(yīng)于較高的培養(yǎng)溫度，增強(qiáng)了胞內(nèi)各種酶的活力，氫氣產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率都得到了顯著提高。

圖3 溫度對(duì)固定化和游離細(xì)胞氫氣產(chǎn)率的影響Fig.3 Hydrogen yield of immobilized and free cells under different temperatures.

表1 不同溫度下對(duì)固定化和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力的比較Table 1 Hydrogen production performance of immobilized and free cells under different temperatures

2.4 葡萄糖濃度的影響

表2是在不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基中，固定化和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力的比較。當(dāng)葡萄糖濃度低于20 g/L時(shí)，隨著葡萄糖濃度的提高，固定化和游離細(xì)胞氫氣產(chǎn)量逐步上升，當(dāng)葡萄糖濃度高于20 g/L時(shí)，固定化細(xì)胞的氫氣產(chǎn)量雖有上升，但增幅變小，而游離細(xì)胞的氫氣產(chǎn)量有所下降。在相同葡萄糖濃度下，固定化細(xì)胞的氫氣產(chǎn)量均高于游離細(xì)胞。在5～20 g/L的葡萄糖濃度范圍內(nèi)，固定化和游離細(xì)胞的底物轉(zhuǎn)化率分別在90%和85%附近，而更高的葡萄糖濃度則導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率的快速下降。隨著葡萄糖濃度的提高，發(fā)酵pH值逐步下降，說(shuō)明混合菌群在產(chǎn)氫的同時(shí)產(chǎn)生酸性副產(chǎn)物，抑制了氫氣的產(chǎn)生。固定化細(xì)胞在葡萄糖濃度低于20 g/L時(shí)，氫氣產(chǎn)率維持在1.40～1.50 mol H2/mol glucose之間，即使在葡萄糖濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，氫氣產(chǎn)率仍可達(dá)到1.27 mol H2/mol glucose，高于同等條件下游離細(xì)胞的 36.6%。這是由于微膠囊內(nèi)葡萄糖的消耗速率大于擴(kuò)散速率，囊內(nèi)葡萄糖濃度一直保持在較低濃度，可以有效避免發(fā)酵過(guò)程中的底物抑制，這和陳國(guó)等[24]的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，20 g/L葡萄糖濃度是產(chǎn)氫細(xì)菌的較適底物濃度，微膠囊包裹的虛擬“細(xì)胞工廠”可以緩解底物抑制，提高氫氣產(chǎn)率，在較高葡萄糖濃度條件下保持混合菌群的產(chǎn)氫活性。

表2 葡萄糖濃度對(duì)固定化和游離細(xì)胞產(chǎn)氫能力的影響比較Table 2 Hydrogen production performance of immobilized and free cells under different glucose concentrations

2.5 多批次發(fā)酵

考察了NaCS/PDMDAAC微膠囊虛擬“細(xì)胞工廠”的產(chǎn)氫穩(wěn)定性和可持續(xù)性，進(jìn)行了多批次搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖 4。由圖可知，氫氣產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)率在前5批發(fā)酵過(guò)程中均逐步上升，在第5批之后分別穩(wěn)定于 400～420 mL和 1.73～1.81 mol H2/mol glucose。對(duì)于前5批發(fā)酵，微膠囊中的菌體濃度從約0.5 mg/L上升到約5 g/L，之后穩(wěn)定在5 g/L左右。由于菌體濃度大幅提高，發(fā)酵時(shí)間由最初的48 h縮短至24 h，因此平均產(chǎn)氫速率從5.89 mL/h提高至17.59 mL/h，提高了198.6% (圖5)?？梢?jiàn)，采用微膠囊固定化混合菌群，大大提高了菌體濃度，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了單位時(shí)間的氫氣產(chǎn)量，顯示出虛擬“細(xì)胞工廠”的優(yōu)勢(shì)。

2.6 液相可溶性發(fā)酵產(chǎn)物分析

考察微膠囊固定化混菌產(chǎn)氫的同時(shí)，還測(cè)定了發(fā)酵液中的其他產(chǎn)物。表 3列出了固定化多批次搖瓶發(fā)酵中主要可溶性發(fā)酵產(chǎn)物的種類和含量。在前5批發(fā)酵中，可溶性發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量逐步增加，到第5批后，總產(chǎn)量穩(wěn)定在4.76～5.45 g/L，主要可溶性產(chǎn)物為丁酸和乙酸，分別占可溶性產(chǎn)物的 37%～45%和 32%～42%。乙醇含量較低，占可溶性產(chǎn)物的14%～27%，產(chǎn)物中沒(méi)有檢測(cè)到一般產(chǎn)氫發(fā)酵中都存在的丙酸。

圖4 固定化產(chǎn)氫細(xì)菌多批次搖瓶發(fā)酵的氫氣產(chǎn)量和產(chǎn)率Fig.4 Hydrogen evolution and hydrogen yield with immobilized cells during repeated batch operation.

圖 5 固定化產(chǎn)氫細(xì)菌多批次搖瓶發(fā)酵的平均產(chǎn)氫速率和每批發(fā)酵時(shí)間Fig.5 Average hydrogen production rate and fermentation time with immobilized cells during repeated batch operations.

氫氣產(chǎn)生過(guò)程中可溶性產(chǎn)物的組成可用于表征菌群的產(chǎn)氫能力，產(chǎn)丁酸和乙酸的過(guò)程通常被認(rèn)為有利于氫氣的產(chǎn)生。Yan等[25]研究表明，產(chǎn)乙醇將消耗代謝過(guò)程中的自由電子，不利于產(chǎn)氫；產(chǎn)丙酸則直接消耗氫氣。對(duì)于本文構(gòu)筑的虛擬“細(xì)胞工廠”體系，丁酸和乙酸含量高達(dá) 73%～86%，發(fā)酵過(guò)程有利于氫氣的產(chǎn)生。

微膠囊固定化細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，菌群存在于微膠囊內(nèi)，過(guò)濾出微膠囊后，得到澄清的發(fā)酵液，便于后期處理，可將各種有價(jià)值的副產(chǎn)物進(jìn)行分離和收集，實(shí)現(xiàn)多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)，提高經(jīng)濟(jì)效益。

表 3 固定化產(chǎn)氫細(xì)菌多批次搖瓶發(fā)酵中的可溶性發(fā)酵產(chǎn)物Table 3 Soluble metabolite production during hydrogen production with immobilized cells in repeated batch operations

3 結(jié)論

本文采用NaCS/PDMDAAC微膠囊體系，固定化混合產(chǎn)氫菌群，構(gòu)建了虛擬的“細(xì)胞工廠”，實(shí)現(xiàn)菌群協(xié)同作用，提高了氫氣產(chǎn)率。結(jié)果表明，微膠囊固定化能夠很好地保持菌群的產(chǎn)氫能力，同時(shí)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。培養(yǎng)溫度和底物濃度都對(duì)產(chǎn)氫能力有較大影響，微囊固定化后菌群的耐受能力有所提高，表現(xiàn)出高產(chǎn)氫活性，最適發(fā)酵溫度為40℃，最佳葡萄糖濃度為20 g/L。實(shí)現(xiàn)了連續(xù)15批培養(yǎng)，微膠囊表現(xiàn)出良好的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的再利用，提高了囊內(nèi)菌體濃度，縮短了發(fā)酵時(shí)間，大大提高了產(chǎn)氫速率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中存在一定量的丁酸和乙酸，可作為副產(chǎn)物回收。結(jié)果證實(shí)NaCS/PDMDAAC微膠囊固定化混合產(chǎn)氫菌群可實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力，相關(guān)深入的機(jī)制探討有待于進(jìn)一步開(kāi)展。

REFERENCES

[1] Winter CJ. Hydrogen energy—Abundant, efficient, clean:a debate over the energy-system-of-change.Int J Hydrogen Energ, 2009, 34(14): S1?S52.

[2] Das D. Advances in biohydrogen production processes: an approach towards commercialization.Int J Hydrogen Energ, 2009, 34(17): 7349?7357.

[3] Barbir F. Transition to renewable energy systems with hydrogen as an energy carrier.Energy, 2009, 34(3):308?312.

[4] Halloran JW. Extraction of hydrogen from fossil fuels with production of solid carbon materials.Int J Hydrogen Energ, 2008, 33(9): 2218?2224.

[5] Ren NQ, Liu BF, Zheng QX,et al. Strategy for enhancing photo-hydrogen production yield by repeated fed-batch cultures.Int J Hydrogen Energ, 2009, 34(18): 7579?7584.

[6] Burgess G, Fernández-Velasco JG. Materials, operational energy inputs, and net energy ratio for photobiological hydrogen production.Int J Hydrogen Energ, 2007, 32(9):1225?1234.

[7] Patrick CH. Fermentative hydrogen production: principles,progress, and prognosis.Int J Hydrogen Energ, 2009,34(17): 7379?7389

[8] Argun H, Kargi F. Effects of sludge pre-treatment method on bio-hydrogen production by dark fermentation of waste ground wheat.Int J Hydrogen Energ, 2009, 34(20):8543?8548.

[9] Yang HH, Guo L, Liu F. Enhanced bio-hydrogen production from corncob by a two-step process: dark- and photo-fermentation.Bioresource Technol, 2010, 101(6):2049?2052.

[10] Li M, Zhao YC, Guo Q,et al. Bio-hydrogen production from food waste and sewage sludge in the presence of aged refuse excavated from refuse landfill.Renew Energ,2008, 33(12): 2573?2579.

[11] Kapdan KI, Kargi F. Bio-hydrogen production from waste materials.Enzyme Microb Tech, 2006, 38(5): 569?582.

[12] Wang CH, Lu WB, Chang JS. Feasibility study on fermentative conversion of raw and hydrolyzed starch to hydrogen using anaerobic mixed microflora.Int J Hydrogen Energ, 2007, 32(16): 3849?3859.

[13] Yao SJ. Study on biocompatibility in a new biomicrocapsule system.Chin J Biotech, 1998, 14(2): 193?197.

姚善涇. 新型生物微膠囊體系的生物相容性研究. 生物工程學(xué)報(bào), 1998, 14(2): 193?197.

[14] Zhang J, Yao SJ, Guan YX. Preparation of macroporous NaCS-PDADMAC capsule and its characteristics.J Membrane Sci, 2005, 255(1/2): 89?98.

[15] Chen G, Yao SJ, Guan YX,et al. Preparation and characterization of NaCS-CMC/PDMDAAC capsules.Colloid Surface B, 2005, 45: 136?143.

[16] Mei LH, Yao SJ. Cultivation and modeling of encapsulatedSaccharomycescerevisiaein NaCSPDMDAAC polyelectrolyte complexes.J Microencapsul,2002, 19(4): 397?405.

[17] Ye ZJ, Yao SJ. Cultivation oflactobacillusin microcapsule.Acta Microbiol Sin, 2000, 40(5): 507?512.

葉子堅(jiān), 姚善涇. 乳桿菌微囊化培養(yǎng)的研究. 微生物學(xué)報(bào), 2000, 40(5): 507?512.

[18] Mei LH, Yang JL, Zhong CL,et al. Cultivation ofBrevibacterium flavumin new microcapsule system and production of glutamic acid.J Zhejiang Univ:Eng Sci,2005, 39(9): 1400?1403.

梅樂(lè)和, 楊建麗, 鐘春龍, 等. 一種新微膠囊固定化黃色短桿菌產(chǎn)谷氨酸研究. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 工學(xué)版, 2005,39(9): 1400?1403.

[19] Zhao YN, Chen G, Yao SJ. Microbial production of 1,3-propanediol from glycerol by encapsulatedKlebsiella pneumoniae. Biochem Eng J, 2006, 32: 93?99.

[20] Mei LH, Yao SJ, Lin DQ,et al. Biocompatibility of NaCS and PDADMAC microcapsules withBacillus thuringiensis.J Chem Ind Eng, 1999, 50(5): 592?597.

梅樂(lè)和, 姚善涇, 林東強(qiáng), 等. NaCS-PDADMAC生物微膠囊對(duì)蘇云金桿菌的生物相容性. 化工學(xué)報(bào), 1999,50(5): 592?597.

[21] Mei LH, Yao JT, Yao SJ. Immobilized culture ofBacillus subtilisin NaCS-PDMDAAC microcapsules for production of new anti-thrombus enzyme.J Chem Ind Eng, 2000, 51(6): 896?898.

梅樂(lè)和, 姚勁挺, 姚善涇. 一株產(chǎn)溶栓酶枯草桿菌的微膠囊固定化培養(yǎng). 化工學(xué)報(bào), 2000, 51(6): 896?898.

[22] Yao SJ. Improved process for preparation of sodium cellulose sulfate.Chem Eng J, 2000, 78: 199?204.

[23] Ma QL. Enrichment and characterization of mixed hydrogen production flora from digested sludge [D]. Hangzhou:Zhejiang University, 2010.

馬茜嵐. 厭氧活性污泥中混合產(chǎn)氫菌群的富集及產(chǎn)氫特性的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2010.

[24] Chen G, Zhao YN, Huang H,et al. 1,3-propanediol production from glycerol byKlebsiella pneumoniaencapsulated in NaCS/PDMDAAC capsules.J Chem Ind Eng, 2006, 57(12): 2933?2937.

陳國(guó), 趙亞囡, 黃和, 等. 微膠囊固定化克雷伯桿菌生產(chǎn)1,3-丙二醇. 化工學(xué)報(bào), 2006, 57(12): 2933?2937.

[25] Yan RT, Zhu CX, Golemboski C,et al. Expression of solvent-forming enzymes and onset of solvent pro-duction in batch culture ofClostridium butyricum.Appl Environ Microb, 1988, 54(3): 642?648.

Immobilization of mixed bacteria by microcapsulation for hydrogen production―a trial of pseudo “Cell Factory”

Qianlan Ma, Dongqiang Lin, and Shanjing Yao

Department of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou310027,China

Received:May 26, 2010;Accepted:September 25, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB7707805).

Corresponding author:Shanjing Yao. Tel/Fax: +86-571-87951982; E-mail: yaosj@zju.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB7707805) 資助。