轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗的研究進展

鄭卿，郭書巧，葛才林，倪萬潮

第1 例轉(zhuǎn)基因煙草表達鏈球菌變異株 SpaA（surface protein antigen A）蛋白疫苗的成功研制[1]，開啟了利用植物表達動物病原抗原蛋白的新紀(jì)元。1992年，Mason 等[2]提出了“轉(zhuǎn)基因植物疫苗”的概念，標(biāo)志著植物口服疫苗成為新藥研發(fā)新途徑的全面展開。

口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗不僅能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全身性的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，還能同時激活黏膜免疫。口服疫苗到達腸內(nèi)黏膜誘導(dǎo)部位之前經(jīng)過胃內(nèi)的不利環(huán)境時必須受到保護，否則有可能被降解而失去免疫原性。而植物細胞壁作為天然的生物膠囊，可保護細胞內(nèi)的疫苗免受消化道酸性環(huán)境和各種酶的降解，使表達的疫苗在小腸內(nèi)緩慢釋放，被小腸上皮的 M 細胞（membrane cell）識別并轉(zhuǎn)運，APC（antigen presenting cell）細胞加工遞呈，使機體產(chǎn)生黏膜和全身性的免疫反應(yīng)，發(fā)揮對機體的全面保護作用[3]。因此，利用植物作為抗原表達和遞送的載體已經(jīng)成為當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點，并取得了長足的發(fā)展。但是食物的加工對目標(biāo)蛋白有一定的破壞，并可能影響其免疫原性。番茄（Lycopersicon esculentum）作為具備良好加工特性的蔬菜，具有全世界的普及性，其口感好，營養(yǎng)豐富，是植物口服疫苗的理想載體。因此，番茄作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)可食性疫苗具有較好應(yīng)用前景。

1 番茄口服疫苗的優(yōu)點

番茄作為外源蛋白的表達系統(tǒng)，除具有植物所共有的優(yōu)點外還具有以下鮮明的特點：

⑴番茄是全球廣泛栽培的一種植物，不易受地域條件的限制，因此有利于進行規(guī)?；a(chǎn)，降低生產(chǎn)成本。

⑵番茄作為一種茄科植物的模式植物，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面有著較為深入的研究，許多成熟的技術(shù)可以直接應(yīng)用于番茄的研究中，這為番茄作為生物反應(yīng)器技術(shù)平臺的建立創(chuàng)造了有利條件。

⑶表達外源蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄果實可以直接食用，在預(yù)防或治療疾病的同時也可以增加營養(yǎng)。還可以將果實制成粉末，進行有效以及長時間的儲存，這樣在植物疫苗和其他藥用蛋白用于疾病的預(yù)防或治療時，不需要經(jīng)過繁雜的分離以及純化步驟，不僅降低了成本和患者的負(fù)擔(dān)，而且使患者能夠從情感上易于接受。

2 番茄口服疫苗的研究進展

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，番茄可被用于生產(chǎn)在醫(yī)學(xué)上有重要應(yīng)用價值的酶或蛋白質(zhì)。目前研究人員已經(jīng)利用番茄作為生物反應(yīng)器，在生產(chǎn)藥用蛋白、抗體、口服疫苗以及其他工業(yè)用品方面做了廣泛的嘗試，多種外源基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入番茄，并表達出有效的蛋白質(zhì)，小鼠實驗[4-8]證明，這些轉(zhuǎn)基因番茄表達的蛋白可以引起有效的免疫反應(yīng)，取得了可喜的成果，研究較多的番茄口服疫苗主要有以下幾種：乙肝病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、霍亂弧菌疫苗、狂犬病病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。

2.1 乙肝病毒轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗

乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是引發(fā)嚴(yán)重慢性肝炎的病原，目前乙肝病毒疫苗的獲得是利用酵母細胞通過發(fā)酵途徑產(chǎn)生的，屬于生物技術(shù)產(chǎn)物下的亞單位疫苗。HBV 在肝 DNA 病毒家族中屬于雙鏈 DNA 病毒。HBV 基因組包括四個基因：pol、env、precore和X，分別編碼病毒的 DNA聚合酶、外殼蛋白、前核心區(qū)蛋白和 X 蛋白。乙肝病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）的主要成分蛋白即是由 env 基因編碼的 S 蛋白。由于 HBsAg 顆?？梢允谷梭w產(chǎn)生專一的抗體，能對病毒的感染起預(yù)防作用[9]，因此科學(xué)家在進行疫苗研制時都將編碼乙肝病毒表面抗原的基因作為研究的重點。

Shchelkunov 等[4]將表達人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的表位 ENV、GAG 和編碼HBsAg 的基因融合，以 CaMV35S 為啟動子構(gòu)建載體，獲得轉(zhuǎn)基因番茄。用表達融合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄果實干粉每2 周飼喂一次小鼠，每 7 d 取一次全血檢測，結(jié)果表明，小鼠對兩種病毒均產(chǎn)生免疫反應(yīng)，說明融合基因可以足量地表達引起免疫反應(yīng)的抗原。Lou 等[10]為了使乙肝病毒表面抗原能在轉(zhuǎn)基因番茄中更好地表達，將煙草致病相關(guān)蛋白（tobacco pathogenesis-related protein S）PR-S 信號肽融合到改良目的基因的 5’ 端，同時將表達氨基酸序列 SEKDEL的基因融合到 3’ 端，利用果實特異性表達的啟動子 2A11，使 HBsAg 大蛋白基因在轉(zhuǎn)基因番茄的果實中特異表達。目的蛋白的最高表達水平占轉(zhuǎn)基因番茄果實可溶蛋白總數(shù)的 0.02%，并且在成熟果實中的表達量是其他組織的 65～171 倍。用免疫金標(biāo)記方法檢測到重組 HBsAg 大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近累積，并且證明所捕獲的 HBsAg 大蛋白微粒仍舊可以保持與人血清中獲得的 HBsAg 具有相同的物理性質(zhì)，且具有很高的免疫原性，據(jù)稱這是首次在植物中表達了HBsAg 大蛋白。近來，He 等[11]在構(gòu)建工程載體時采用 E8啟動子，在番茄中表達了乙肝病毒表面抗原（HBV S2 +S/HBsAgM），E8 啟動子使得抗原僅在成熟的番茄果實中表達。

何乃彥等[12]將 HBsAg/截短型丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）核心蛋白融合基因重組到植物表達載體pBin438 的強組成型啟動子 CaMV35S 及增強子下游，構(gòu)建表達載體 pBin438BE，并轉(zhuǎn)化番茄。從轉(zhuǎn)基因番茄植株中提取總蛋白，經(jīng) Dot blot 實驗證明 HBsAg/截短型 HCV核心蛋白的融合蛋白在轉(zhuǎn)基因番茄中得到了表達。王逸群和李田[13]將 HBsAg 基因?qū)敕眩晒Λ@得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。果洪宇等[14]也成功將 HBV S/HEV ORF2 融合基因轉(zhuǎn)入番茄，并獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2.2 口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）屬于小 RNA 病毒科口蹄疫病毒屬，F(xiàn)MDV 基因組的中部是一個大的開放閱讀框，編碼一多聚蛋白，開放閱讀框由 L 基因、 P1 結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2 和 P3 非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成。多聚蛋白經(jīng)過初級裂解形成L-P1-2A、2BC 和 P3 三種前體蛋白，16 個氨基酸的多肽2A 催化 P1-2A 從 2BC 連接處順式切割；次級裂解由 3C蛋白酶完成[15-16]，P1-2A 被 3C 蛋白酶催化加工成 VP0、VP3 和 VP1，這 3 種蛋白相互聯(lián)系并能夠自我組裝成二十面體的核衣殼，在病毒粒子最后形成階段 VP0 經(jīng)成熟裂解為VP2 和 VP4，病毒 RNA 組裝進入 75S 的空衣殼形成完整的病毒粒子[17-18]。

潘麗等[5]構(gòu)建了 O 型口蹄疫病毒 China99株結(jié)構(gòu)蛋白 P1-2A、非結(jié)構(gòu)蛋白 3C 以及部分 2B 基因（P1-2X3C）的植物雙元表達載體 pBin438/P1-2X3C，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，經(jīng)過 ELISA 和 Western blot 檢測表明轉(zhuǎn)基因植株中表達的目的蛋白具有抗原性。轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白粗提液經(jīng)肌肉注射免疫豚鼠，于第3 次免疫后 28 d 用100ID50/0.2 ml 的同源強毒攻擊，結(jié)果表明口蹄疫病毒P1-2X3C 基因的轉(zhuǎn)基因番茄表達產(chǎn)物具有良好的抗原性，豚鼠經(jīng) 3 次免疫后血清效價可達 1∶64～1∶128，攻毒后兩組免疫豚鼠保護率分別達 60%和 100%。Chen 等[8]在番茄中成功表達了 VP1 蛋白，在給 VP1 加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列后，使得蛋白在番茄鮮果實中的表達量增加到 27 μg/g，隨后用表達 VP1 蛋白的番茄果實喂養(yǎng)小鼠，小鼠產(chǎn)生了EV71 特異性的抗血清和免疫球蛋白，并且發(fā)現(xiàn)小鼠的抗血清明顯抑制了 EV71 病毒對橫紋肌肉瘤細胞的感染。

2.3 霍亂毒素 B 亞單位轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）分泌的霍亂毒素（cholera toxin，CT）可引起動物和人類重度脫水性腹瀉。CT 由 A 亞單位（CT-A）和 5 個 B 亞單位（CT-B）組成，其中 CT-B可以與靶細胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）受體結(jié)合，CT-A 則決定毒素的性質(zhì)。CT-B 的五聚物能在不同物種的植物中生產(chǎn)?；魜y弧菌的毒素共調(diào)菌毛（toxin co-regulated pilus，Tcp）是其主要黏附素之一，也是一種保護性抗原。輔助定居因子（accessory colonization factor，acf）基因簇包括 B、C、A、D四個基因，編碼的四種蛋白與 Tcp 和 CT 的形成以及霍亂弧菌的黏附定植相關(guān)[19]。

彭志強等[20]以 Ca35S 為啟動子，構(gòu)建了表達 CT-B 基因的載體，轉(zhuǎn)入番茄，獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株，且轉(zhuǎn)基因植株能夠有效表達 CT-B 多肽，多肽表達量占番茄葉片可溶性蛋白的 0.055%。之后，這一研究小組又利用番茄果實特異性啟動子—— E8 啟動子，將 CT-B 轉(zhuǎn)入番茄植株，并使其在果實中特異表達，然后對試驗小鼠進行口服免疫，研究轉(zhuǎn)基因番茄果實的免疫原性。結(jié)果表明，CT-B 基因在14株番茄植株基因組中被整合，并在其中 2株的番茄果實中有特異性表達，最高表達量分別為455 和 385 ng·g-1FW（鮮重），口服免疫后的小鼠血液和腸道黏膜中均檢測到抗CT-B 抗體。表明獲得了在番茄果實中特異、高效表達霍亂腸毒素 B 亞單位基因（CT-B）的植物口服疫苗候選植株[21]。Jiang 等[6]也利用 E8 啟動子驅(qū)動 CT-B 基因，轉(zhuǎn)化番茄，在轉(zhuǎn)基因番茄植株果實中，CT-B 最高含量占可溶性總蛋白的 0.081%，將轉(zhuǎn)基因番茄喂養(yǎng)小鼠后，其血清中也產(chǎn)生了CT-B 亞單位特異性抗體，并發(fā)現(xiàn)植物纖維對產(chǎn)生的蛋白在消化過程中具有保護作用。Sharma 等[19]成功將霍亂病毒輔助定居因子 A 亞單位（acf-A）與霍亂毒素 B 亞單位（CT-B）在番茄中融合表達，轉(zhuǎn)基因植株中融合蛋白占果實可溶蛋白的 0.25%，占植株可溶蛋白的 0.08%。這種融合蛋白在番茄中的成功表達，有望產(chǎn)生更多有潛能的重組抗體。

2.4 其他轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗

除以上幾種疫苗外，番茄還是呼吸道合胞病毒、狂犬病、艾滋病、糖尿病等疫苗研制過程中的反應(yīng)器。Sandhu 等[7]在果實特異性 E8 啟動子的控制下，成功實現(xiàn)了呼吸系統(tǒng)病毒 RSV 的 F 蛋白在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達。1995年，McGarvey 等[22]首次在番茄中表達了狂犬病病毒 G 蛋白，該蛋白在 CaMV35S 啟動子的驅(qū)動下，在番茄葉子及果實中都得到了表達，所表達的蛋白相對分子質(zhì)量為60 和62 kD，比在 BHK 細胞（baby hamster kidney cell）中表達的 66 kD 略小，主要定位于高爾基體、小囊泡、質(zhì)膜和細胞壁上，小鼠口服免疫后能誘發(fā)特異性保護性免疫應(yīng)答。陳溪和林忠平[23]利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)人胰島素，以口服方式攝入胰島素來研究抑制自身免疫攻擊以及預(yù)防 I 型糖尿病中所起到的作用，己經(jīng)取得了很大的進展。周曉紅等[24]獲得了能夠表達弓形蟲多表位抗原基因（toxoplasma gondii multiepitope antigenic gene，T-g MAG）的轉(zhuǎn)基因番茄苗，其中兩株陽性轉(zhuǎn)基因番茄的果實中所表達的重組蛋白能與抗弓形蟲速殖子主要表面抗原 1（SAG1）單克隆抗體 K7H3發(fā)生強免疫反應(yīng)。Youm 等[25]將人 β 淀粉樣蛋白（β amyloid protein，β-A）基因串聯(lián)重復(fù)序列轉(zhuǎn)入番茄基因組，獲得了表達 β-A 抗體即抗阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因番茄植株。

3 番茄口服疫苗面臨的問題及解決方法

番茄作為可食用植物應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生產(chǎn)，已成功表達了多種外源蛋白，在動物實驗方面取得了重要進展。但目前尚有許多問題有待解決。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗存在兩個缺點：①蛋白表達量低；②口服時少量被消化。研究人員針對第一種情況，考慮使用強啟動子、前導(dǎo)序列和增強子，優(yōu)化選擇的密碼子，mRNA 去穩(wěn)定序列的去除，整合非依賴性的表達，通過協(xié)同表達二硫鍵異構(gòu)酶或伴侶蛋白促進蛋白質(zhì)的正確表達，通過修飾抗原蛋白基因序列將其定靶于胞內(nèi)部分，如葉綠體[26]、質(zhì)體[27]等來提高表達水平；針對第二種情況，采取在抗原基因附近加上一些修飾基因或吸附基因序列（如菌毛蛋白基因），保護口服疫苗不易被迅速消化，使之長時間地停留在消化系統(tǒng)內(nèi)[28]。

另外，轉(zhuǎn)基因食品的安全性也是一個重要的問題，在轉(zhuǎn)基因設(shè)計和操作時，要切實從提高安全性和提高表達效率的角度出發(fā)，例如使用非抗生素類篩選標(biāo)記、開展葉綠體轉(zhuǎn)基因、實行多基因同時轉(zhuǎn)化，乃至后加工過程技術(shù)采用等，使?jié)撛诘奈ｋU性降到最低。

4 應(yīng)用前景

番茄作為可食用植物應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生產(chǎn)，展示出了良好的應(yīng)用前景。要想實現(xiàn)植物可食用疫苗的商業(yè)化，下游的疫苗制備工藝和臨床免疫實驗是不容忽視的。轉(zhuǎn)基因番茄除了供人類食用外，還將成為大量生產(chǎn)目的產(chǎn)品的生物反應(yīng)平臺。例如在次生代謝物、腫瘤疫苗的生產(chǎn)、預(yù)防性疫苗的生產(chǎn)、人畜共患病的預(yù)防和治療以及動物激素代謝的研究方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。Mor 等[29]將乙酰膽堿酯酶基因轉(zhuǎn)入番茄，獲得了能產(chǎn)生這種乙酰膽堿酯酶的轉(zhuǎn)基因番茄。乙酰膽堿酯酶是對有機磷中毒進行解毒的重要藥品，是一種醫(yī)用價值很高的藥用蛋白，從轉(zhuǎn)基因番茄中提取的乙酰膽堿酯酶活性高、穩(wěn)定性強，和人體來源的酶具有基本相同的生理學(xué)特征。基于口服耐受性以及其他方面的原因，目前轉(zhuǎn)基因植物疫苗投入臨床實驗的種類并不是很多[30]，而轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗投入臨床研究的事例目前為止未見報道。在加速轉(zhuǎn)基因植物疫苗產(chǎn)業(yè)化的過程中，我們必須對其安全性給予足夠的重視，在轉(zhuǎn)基因番茄的研究中，Zhou 等[27]利用一種不同的轉(zhuǎn)基因方法——轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的研究表明，通過轉(zhuǎn)基因質(zhì)體方法表達的 HIV 抗原，有作為艾滋病疫苗成分的潛力。HIV 病毒抗原 p24 和 Nef 可以在煙草以及番茄的質(zhì)體中高水平的表達，p24-Nef 融合基因表達盒能激發(fā)抗原蛋白的表達，表達量累積約占整個植株總蛋白的 40%，證明了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組途徑有可能成為生產(chǎn)艾滋病疫苗的低投入高產(chǎn)出的方法，是分子農(nóng)業(yè)發(fā)展的新方向。質(zhì)體中的細胞器可以高水平的積累外源蛋白，并且由于母系遺傳的關(guān)系，可以保證生物研究的安全性。雖然安全性問題仍舊沒有徹底解決，但也不能因此減緩轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，甚至忽視或否定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品帶給人類的益處。相信只要措施得當(dāng)，轉(zhuǎn)基因番茄疫苗必將造福于人類。

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