高性價比寡核苷酸基因表達(dá)譜芯片的制備方法

任永紅，張科，孫清嵐，王亞輝，莊遠(yuǎn)紅，張亮

隨著人類基因組學(xué)研究的不斷進(jìn)展，基因芯片正逐步成為檢測基因表達(dá)最強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)方法。根據(jù)芯片上點(diǎn)制的探針不同，基因芯片主要可分為cDNA 芯片和寡核苷酸（Oligo）芯片 2 種類型。cDNA 芯片是將一些基因片段通過 PCR 方式制備探針，在早期應(yīng)用比較常見[1]。然而隨著越來越多的生物物種基因組測序的完成，Oligo 探針的設(shè)計成為可能，由于Oligo 芯片的特異性較cDNA 芯片好，并且制備起來不需要經(jīng)過繁瑣的PCR 擴(kuò)增和純化回收過程，因此 Oligo 芯片已逐漸成為基因芯片中的應(yīng)用主流。目前制備 Oligo 芯片主要有 2 種方式[2]：第一種是在線方式（on line）的原位制作技術(shù)[3-4]，即在基片介質(zhì)上直接合成DNA 探針，例如美國 Affymetrix公司利用光刻掩膜方式在硅基片表面原位合成 25-mer 長度的Oligo 探針、美國 Agilent公司利用噴墨（ink-jet）方式在玻片表面合成 60-mer 長度的Oligo 探針、美國 LC Science公司利用酸堿法在硅基片表面非光刻掩膜合成 Oligo 探針等；第二種是離線方式（off line）的點(diǎn)制芯片技術(shù)[5-6]，即先利用 DNA 合成儀合成 Oligo 探針，然后用芯片點(diǎn)樣儀將 Oligo探針精確點(diǎn)制到基片表面上。第一類芯片制備方式需要復(fù)雜的設(shè)備、技術(shù)以及大量資金投入，只能由專門的實(shí)驗(yàn)室制備；第二種芯片制備方法需要的硬件設(shè)備和操作技能都可以被一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所接受，并且點(diǎn)制芯片的制備方法是一個開放的平臺，研究者可以根據(jù)自己的研究目的制備多種類型的基因芯片，非常適合實(shí)驗(yàn)室自行建立自己的基因芯片平臺。

目前國際上一些商業(yè)芯片公司在點(diǎn)制芯片的時候多用 60～70-mer 長度的探針，例如美國的Operon公司（擁有包括人、大鼠、小鼠等多個物種的全基因組Oligo 庫，其探針長度通常為70-mer）。從 Oligo 探針的合成效率和合成難度角度考慮，探針越長，單位價格越高?，F(xiàn)今國內(nèi)大多數(shù)公司就是以 60-mer 長度為界，探針合成價格相差 3 倍，但目前還沒有詳細(xì)的關(guān)于60-mer 長度以上和以下探針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的研究報道。另外在檢測基因表達(dá)時，由于原核生物的mRNA 不含PolyA，難于針對 mRNA 進(jìn)行特異性標(biāo)記，因此針對原核生物的基因表達(dá)檢測要遠(yuǎn)比真核生物困難。鑒于此，我們選擇大腸桿菌基因表達(dá)信息作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?59-mer和70-mer 長度 Oligo 探針的雜交信號進(jìn)行分析比較，以探討探針長度對寡核苷酸基因芯片性價比優(yōu)勢的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 E.coli ATCC11775 菌株、晶芯 cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒（Cat#.360060）、DNA 點(diǎn)樣液、PersonalArrayer16TM芯片點(diǎn)樣儀、BioMixerTMII 芯片雜交儀、SlideWasherTM8 芯片清洗儀、LuxScanTM10K-A 激光共聚焦掃描儀、LuxScan 3.0數(shù)據(jù)分析軟件均為博奧生物有限公司產(chǎn)品，溶菌酶（lysozyme）（Cat#.RT401）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，NucleoSpin RNA II 試劑盒（Cat#.740.955.10）為德國 Machery Nagel（MN）公司產(chǎn)品，MessageAmp II-Bacteria 試劑盒（Cat#.1790）為美國 Ambion公司產(chǎn)品，ND-1000 型紫外分光光度計為美國 NanoDrop公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 從平板上挑取新的活化后E.coli ATCC11775 單菌落，接種于5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 12 h。取 50 μl 菌液轉(zhuǎn)入 5ml LB 中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 1～1.5 h 至對數(shù)生長期、吸光度（A600）值為0.5 左右。

1.2.2 菌株 RNA 提取 在1.5ml EP 管中加入1ml 菌液，14000×g 離心 2 min，吸棄上清。加入 100 μl 新鮮配制的1×TE 緩沖液（含有0.2 mg/ml 溶菌酶）重懸菌體，輕彈管壁混勻，37 ℃孵育 10 min。然后按照 NucleoSpin RNA II 試劑盒說明書提取 E.coli RNA。提取的RNA 樣品用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測，紫外分光光度計測量濃度，計算 RNA 總量，將 2個樣品等量混合用于后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 探針設(shè)計與芯片點(diǎn)制 根據(jù)博奧生物有限公司已有大腸桿菌全基因組芯片數(shù)據(jù)選擇覆蓋高、中、低雜交信號強(qiáng)度的大腸桿菌基因共 20個。針對該 20個基因分別設(shè)計 59-mer和70-mer 長度的Oligo 探針（探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），探針序列見表1。將 Oligo 探針溶于點(diǎn)樣液中并調(diào)至終濃度為20 μmol/L，利用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制在經(jīng)過氨基修飾的基片上，每個探針重復(fù)2個點(diǎn)，點(diǎn)間距為250 μm，每個點(diǎn)陣共包含 10 行、10 列，探針分布示意圖見圖 1。點(diǎn)制于芯片上的樣品還包括用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程的外標(biāo)探針 Y1-Y8、用于監(jiān)控核酸固定的Hex 探針 PC，以及陰性對照點(diǎn)樣液 NC。同時制備 4 張完全相同的芯片，點(diǎn)制好的芯片干燥后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 20個大腸桿菌基因的59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針序列Table1 The 59-mer and 70-mer oligo probes sequences of 20 E.coli genes

圖1 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針的芯片點(diǎn)陣分布Figure1 The probe layout of the 59-mer and 70-mer oligo probes on the array

1.2.4 芯片檢測

1.2.4.1 RNA 樣品標(biāo)記 首先采用 MessageAmp II-Bacteria 試劑盒對 RNA 進(jìn)行 Ploy A 加尾，利用 T7 Oligo（dT）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成一鏈 cDNA，DNA 聚合酶合成 cDNA 第二鏈，以雙鏈 DNA 為模板經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成 cRNA。參照文獻(xiàn)[7-11]改良方法，利用 cRNA 擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒對 cRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 DNA，最后在Klenow 酶的作用下利用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，延伸過程中加入熒光素，具體標(biāo)記步驟見圖 2。

1.2.4.2 芯片預(yù)處理 將芯片點(diǎn)制有探針的一面在65 ℃ 水浴鍋上水合處理 2 次，每次 10 s。250 mJ 紫外強(qiáng)度下交聯(lián)，42 ℃ 預(yù)熱 0.5% SDS 清洗 10 min，42 ℃ 預(yù)熱蒸餾水清洗 2 min，離心甩干。

1.2.4.3 芯片雜交 將標(biāo)記后樣品加入含有 3×SSC、0.2% SDS、5×Dehart’t、25% 甲酰胺的雜交緩沖液中，42 ℃ 雜交 12～16 h，在芯片清洗儀中用 42 ℃ 預(yù)熱的洗液 I（2×SSC、0.2% SDS）和42 ℃ 預(yù)熱的洗液 II（0.2% SSC）分別清洗 4 min，離心甩干。重復(fù)雜交 4 張芯片。

圖2 大腸桿菌 RNA 樣品擴(kuò)增標(biāo)記過程示意圖Figure2 Flow diagram for labeling E.coli RNA samples

1.2.4.4 芯片掃描 采用 LuxScanTM10K-A 激光共聚焦掃描儀掃描芯片獲取圖像，利用 LuxScan 3.0數(shù)據(jù)分析軟件將圖形文件轉(zhuǎn)換為數(shù)字文件，提取獲得 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用 Paired t test 進(jìn)行顯著性分析，利用 Excel 計算各探針的雜交信號值（），以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探針設(shè)計

根據(jù)博奧生物有限公司已有大腸桿菌全基因組芯片數(shù)據(jù)選擇覆蓋高、中、低雜交信號強(qiáng)度的20個大腸桿菌基因分別設(shè)計 59-mer和70-mer長度 Oligo 探針，使得探針更具有生物學(xué)代表性；同時將 59-mer 長度探針設(shè)計位于70-mer 長度探針的內(nèi)部，以防止芯片雜交信號的差異與堿基組成有關(guān)。

2.2 大腸桿菌 RNA 質(zhì)檢

甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示大腸桿菌 28S rRNA和18S rRNA 條帶清晰，無降解帶出現(xiàn)，質(zhì)量合格（圖 3）。

圖3 大腸桿菌 RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測Figure3 Formaldehyde denatured agarose gel electrophoresis of E.coli total RNA

2.3 芯片檢測

我們將 59-mer和70-mer 長度探針點(diǎn)制在同一個芯片點(diǎn)陣中，一次雜交過程即可并行比較 2 種長度探針的雜交信號，以防止 2 種探針由于分布在不同芯片中所導(dǎo)致的雜交信號差異，共進(jìn)行了4 張芯片的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。芯片雜交結(jié)果顯示同一個芯片中的59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號沒有差異（圖 4），陽性對照探針 Y1-Y8、PC 出現(xiàn)陽性雜交信號，陰性對照點(diǎn)樣液 NC 未檢測到雜交信號，符合質(zhì)控要求，因此判斷芯片雜交實(shí)驗(yàn)成功。

2.4 雜交信號強(qiáng)度分析

圖4 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針芯片雜交圖Figure4 Hybridization figures of 59-mer and 70-mer oligo probes

為了直觀地比較 2 種探針的雜交信號，利用Excel 計算各探針的雜交信號值，并采用 Paired T test 進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明 59-mer和70-mer長度探針的雜交效率和雜交信號差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.9810）（圖 5）。

圖5 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針的雜交信號強(qiáng)度Figure5 The hybridization signal intensities of 59-mer and 70-mer oligo probes

3 討論

以不同長度 Oligo 探針基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)檢測最主要的影響因素是探針的雜交信號，若雜交信號弱，會導(dǎo)致檢測信息丟失，出現(xiàn)假陰性。已有研究表明，短探針的雜交信號會較長探針弱，并且穩(wěn)定性差[12-13]，例如美國 Affymetrix公司制備的基因芯片探針長度只有 25-mer，得到的雜交信號較弱，為了彌補(bǔ)該缺陷，減少由于探針雜交信號弱導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，他們針對一個基因設(shè)計了多條探針，并且分為完全匹配和錯配的探針，利用多條探針的雜交信號值檢測豐度很低的基因。Affymetrix公司設(shè)計完全匹配和錯配的多條探針檢測基因表達(dá)的技術(shù)在一般實(shí)驗(yàn)室難以進(jìn)行，而其他的芯片公司，例如美國 Agilent和Roche NimbleGen公司都是利用 60-mer 以上長度的探針檢測包括原核和真核生物細(xì)胞的基因表達(dá)信息，這樣設(shè)計的芯片不用考慮設(shè)計完全匹配和錯配等多條探針，通過設(shè)計一條可靠的探針就能檢測到一個基因的表達(dá)信息，這種Oligo 探針基因芯片設(shè)計方法在一般實(shí)驗(yàn)室都可以實(shí)現(xiàn)。但在國外已有的研究中都沒有考慮到探針合成的成本問題；而在國內(nèi)，60-mer 長度就是探針合成長度的一個分界線，價格差異很大，長度在60-mer 以上探針的合成費(fèi)用是 60-mer 以下探針的3 倍以上，例如目前國內(nèi) 59-mer 長度探針的合成價格約為每個堿基 1.4 元，而 70-mer 長度探針的合成價格約為每個堿基 4.0 元。因此，結(jié)合探針長度對于雜交信號的影響以及探針的合成成本，我們對 59-mer和70-mer 長度探針對雜交信號強(qiáng)度的影響進(jìn)行了分析比較。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了基因表達(dá)檢測難度較大的原核生物大腸桿菌的基因表達(dá)為模型，篩選出覆蓋高、中、低雜交信號強(qiáng)度的20個大腸桿菌基因，比較了 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號，結(jié)果表明 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號沒有顯著差異。而對于真核生物，已有研究表明 50～70-mer 長度的Oligo 探針均具有良好的特異性和靈敏度[14-17]，我們也成功應(yīng)用 59-mer 長度探針檢測了定制的60個大鼠基因的表達(dá)信息[18]，因此 59-mer 長度探針也可以用于檢測真核生物的基因表達(dá)信息。綜上，59-mer 長度探針合成費(fèi)用不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于70-mer 長度探針，而且雜交信號強(qiáng)度也沒有明顯降低，可用于制備具有高性價比優(yōu)勢的寡核苷酸基因芯片，從而推動基因芯片技術(shù)更為廣泛的應(yīng)用。

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