鈦鈮涂層鎳鈦記憶合金的生物安全性及生物相容性

汪愛媛，李永濱，許文靜，彭江，郭全義，趙斌，張莉，盧世璧

鎳鈦形狀記憶合金因具有形狀記憶效應(yīng)、超彈性、較高的疲勞極限、優(yōu)良的耐磨性及良好的生物相容性而備受醫(yī)學(xué)界推崇。但伴隨應(yīng)用的擴(kuò)大，NiTi記憶合金鎳離子析出引發(fā)的安全性問題，成為亟需研究解決的難題。TiNb 合金為一惰性材料，以其突出的穩(wěn)定性、良好的生物相容性受到醫(yī)學(xué)界的重視。通過體外研究結(jié)果顯示：鈦鈮涂層修飾可防止或減少 NiTi 記憶合金中 Ni2+的析出，并保持一定的形狀記憶效應(yīng)[1-3]。本論文研究 Ti 涂層及TiNb涂層的表面形貌及其對 Ni2+的屏蔽，體內(nèi)各器官Ni2+的聚集和肌肉組織生物相容性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 NiTi 記憶合金由北京百慕航材高科技股份有限公司提供；丙酮購自北京化工廠；超純水為美國 Millipore公司超純水系統(tǒng)產(chǎn)出，熱源濃度 0.001 eu/ml。

1.1.2 儀器 KQ-100VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；101-2 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱為上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠產(chǎn)品；XSAM800 型 X 射線光電子能譜為英國 Kratos公司的產(chǎn)品；JSM-35C 型掃描電鏡為日本電子公司的產(chǎn)品；XGT-2700 型 X 射線熒光分析顯微鏡為日本堀場公司產(chǎn)品；SOLAAR-M6 型石墨爐原子吸收光譜儀為美國熱電公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 選取成年雜種狗 18只，雌雄各半，體重（15±2）kg。由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為4組，NiTi 合金未涂層組、Ti 涂層組、TiNb 涂層組各 5只，空白組3只。觀察時間為12個月。

1.2 方法

1.2.1 植入體的制備 NiTi 記憶合金分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，NiTi組：由其鑄件條材和柱材切割后經(jīng)過 SiC 砂紙逐級打磨拋光，去除表面雜質(zhì)及污染物，制備成 10 mm×10 mm×10 mm 立方體，含Ni（原子比）48.4%，Ti 含量 51.6%；Ti 涂層組：以 NiTi 合金為基體，表面采用磁控濺射技術(shù)進(jìn)行金屬鈦涂層；TiNb 涂層組：以 NiTi 合金為基體，表面采用同種技術(shù)進(jìn)行鈦鈮合金涂層，涂層厚度同Ti 涂層組，工藝均在德國 KCH公司完成。

1.2.2 植入過程 氯氨酮等復(fù)合靜脈麻醉，術(shù)區(qū)備皮，消毒，取腰椎后正中切口，長約 10～12 cm，輕輕分離骶棘肌，實(shí)驗(yàn)組動物埋入立方體試件，每側(cè) 5 枚，共 10 枚，相距 2.5～3.0 cm，深度 1.2 cm（圖 1）?？瞻讓φ战M術(shù)式相同，只是不植入任何物體即縫合。

圖1 立方植入體的植入Figure1 Implanted of the cubic implantations

術(shù)后肌注慶大霉素 8萬 U，1 次/日，共 3 d預(yù)防感染。分籠飼養(yǎng)，食用統(tǒng)一飼料。

1.2.3 取材和觀察指標(biāo) 術(shù)后12個月處死動物取材，用陶瓷刀分別對每只犬的心、肝、脾、肺、腎、腦、骨、鼻咽黏膜、肌肉進(jìn)行取材，去離子水沖洗后，獨(dú)立封裝，深低溫冷凍備用。送檢前置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)（40×10-2Pa，–45 ℃）干燥 7 d，石墨爐原子吸收儀（GFAAS）檢測各組織或器官內(nèi)的Ni2+含量。

銳刀切取植入體周圍纖維囊和肌肉組織，10%甲醛溶液固定、脫水、常規(guī) HE 染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察。對植入體周圍纖維囊厚度進(jìn)行顯微鏡下測量和結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4 評價標(biāo)準(zhǔn) 本實(shí)驗(yàn)全部按照《醫(yī)療器械監(jiān)督管理和評價》（以下簡稱《評價》）有關(guān)醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)、取材和評價[4]。組織反應(yīng)分級：I 級，試樣周圍未見或僅見極少量淋巴細(xì)胞；II 級，試樣周圍可見少量淋巴細(xì)胞；III 級，試樣周圍有少量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤和巨細(xì)胞反應(yīng)；IV 級，試樣周圍可見以嗜中性粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，可見吞噬細(xì)胞。植入體周圍纖維囊（FCAI）：I 級，F(xiàn)CAI 厚度穩(wěn)定且≤ 0.03 mm，無繼續(xù)增生現(xiàn)象；II 級，F(xiàn)CAI 壁致密，壁的厚度比形成初期要??；III 級，植入體周圍可見纖維母細(xì)胞與膠原纖維，并已形成纖維囊腔結(jié)構(gòu)；IV 級，植入體周圍可見小血管與纖維母細(xì)胞增生，開始形成疏松的囊壁。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS10.0 進(jìn)行單因素方差分析和t 檢驗(yàn)，以 P＜0.05 說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涂層后NiTi 合金表面成分的檢測

采用 XPS 方法通過結(jié)合能檢測其表面成分，刻蝕深度 0.1 μm，結(jié)果見表1。

未涂層 NiTi 合金樣品表面存在1.294%的鎳元素，而涂層組樣品表面均未測出鎳元素。同時TiNb 涂層組樣品表面檢測出2.992%的Nb 元素，而 Ti 涂層組樣品表面的Ti 元素含量增高。

2.2 涂層表面分析及厚度測量

采用斷口技術(shù)，用 SEM 觀察 NiTi 表面，可見明亮的光電反應(yīng)層（圖 2A），經(jīng)過 Ti 或 TiNb涂層后，可見明顯界面（圖 2B），采用 X 射線熒光分析顯微鏡觀察，涂層更加清晰可見（圖 2C），黃色熒光帶為Ti 或 TiNb 涂層材料，黑色為背景色，涂層光滑，均勻，涂層厚度 3.25 μm。

2.3 鎳離子含量檢測

肝、腎、骨、肌肉等器官或組織中 Ni2+含量，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，NiTi 無涂層組的肝、腎組織內(nèi)的鎳離子濃度分別為4.30和12.14 μg/kg，遠(yuǎn)高于空白對照組和涂層組，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

表1 NiTi 及Ti、TiNb 涂層后表面成分含量（%）Table1 Content of surface component on NiTi alloy, Ti coated and TiNb coated alloys (%)

圖2 涂層表面分析Figure2 Surface analysis of coatings

表2 組織或器官中 Ni2+ 含量（干重均值，μg/kg）Table2 Concentrations of Ni2+ in tissues or organs (dry-weight, mean value, μg/kg)

圖3 骶棘肌內(nèi)植入標(biāo)本 （A：NiTi 未涂層組；B：Ti 涂層組；C：TiNb 涂層組）Figure3 Implants embedded in sacrospinalis.A: NiTi group; B: Ti-coated group; C: TiNb-coated group.

2.4 組織相容性

三組植入體周圍均未見明顯滲出和水腫，纖維囊外肌肉色澤形態(tài)正常（圖 3），均具有良好的組織相容性，但 NiTi組植入體取材時植入體和纖維囊的結(jié)合較弱。

組織學(xué)圖片顯示三組植入體周圍均未見明顯巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，偶爾可見少量淋巴細(xì)胞（圖 4）。

將植入體周圍纖維囊剖開，取出植入體，銳刀切取部分非棱角處纖維囊及附帶的肌肉組織，固定后垂直于纖維囊和肌肉切片，顯微鏡下測量，每組各取 30 枚標(biāo)本。NiTi組、Ti 涂層組、TiNb 涂層組纖維囊厚度分別為38.8、25.8和26.1 μm（表3）；NiTi 無涂層組纖維囊厚度最高，且與兩涂層組存在顯著差異（P＜0.01）；Ti 涂層組和TiNb 涂層組的纖維囊厚度沒有顯著差異（P ＞0.05）。

圖4 HE 染色組織學(xué)圖片（10×10）（A：NiTi組；B：Ti 涂層組；C：TiNb 涂層組）Figure4 HE-stained histological image (10×10).A, B and C represent NiTi group, Ti-coated group and TiNb-coated group.

表3 三組植入體周圍纖維囊厚度（μm， ）Table3 The thickness of fibrous capsule around implants in three groups (μm, )

表3 三組植入體周圍纖維囊厚度（μm， ）Table3 The thickness of fibrous capsule around implants in three groups (μm, )

注：a與NiTi組相比 P＜0.01；b與TiNb 涂層組相比 P ＞0.05Notes: a P＜0.01 vs.NiTi group; b P ＞0.05 vs.TiNb-coated group.

植入體Implants纖維囊厚度Thickness of fibrous capsule NiTi組 NiTi group 38.8±0.72 Ti 涂層組 Ti-coated group 25.8±0.53 a, b TiNb 涂層組 TiNb-coated group 26.1±0.66 a

3 討論

鎳鈦記憶合金是目前較為成熟的、唯一應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的記憶合金，具有獨(dú)特的超彈性和形狀記憶性能，具有巨大的開發(fā)和應(yīng)用價值。然而，由于鎳的毒性已有大量文獻(xiàn)報道，可引起嚴(yán)重的局部組織刺激、壞死、過敏和潛在的致癌性，使得 NiTi 合金的臨床應(yīng)用受到了一定限制。雖然 NiTi 記憶合金中的Ni是以化合態(tài)形式存在，其毒性遠(yuǎn)比單質(zhì)Ni 小，但防止鎳離子的析出，進(jìn)一步提高 NiTi 合金的生物相容性和生物安全性不容忽視。

目前解決鎳離子析出的方法主要是記憶合金表面改性和修飾處理。主要有兩種途徑，一類是在記憶合金的表面附加一層保護(hù)屏障，阻止鎳離子的彌散，如 TiN、TiC和TiB2等；第二類是增加氧化層的厚度，對抗鎳離子的彌散。比較兩類表面處理方法的差異，尤其是作為骨科應(yīng)用的植入物，第一類 TiN等涂覆保護(hù)層抗腐蝕，強(qiáng)度高，但長時間植入體內(nèi)仍然起化學(xué)反應(yīng)，為TiN + O2→ TiO2+1/2N2。氧化反應(yīng)發(fā)生后，材料表面的機(jī)械特性、電特性和電化學(xué)性也同時改變[5]。而第二類生成氧化層的方式研究較多，且對記憶合金的形狀記憶功能及超彈性影響較小，但存在氧化處理后外層鎳離子濃度升高及耐磨損差的缺點(diǎn)。因此，選擇一種惰性更高，強(qiáng)度更強(qiáng)，具有良好生物相容性的材料對NiTi 記憶合金表面進(jìn)行涂層處理，可能是解決這一問題的關(guān)鍵。

在金屬材料中，通常認(rèn)為鈦是無毒性的[6]。鈮國內(nèi)研究較晚，但國外已進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，目前證明是具有良好生物相容性的金屬材料[7-9]，其與鈦的合金制品已進(jìn)入臨床。

本研究中植入體涂層前 NiTi 表面含鈦3.396%，含鎳 1.294%。植入體內(nèi)后，未經(jīng)涂層處理的NiTi組肝、腎組織中 Ni2+含量分別是空白組的1.6和2.4 倍；這可能與試件在體內(nèi)的磨損有關(guān)。經(jīng) Ti 涂層后表面含鈦比例明顯增高，而表面Ni 元素消失；經(jīng) TiNb 涂層后，結(jié)果相似，并增加了 2.994%的Nb 元素。

經(jīng) Ti、TiNb 涂層后，試件周圍骨和肌肉組織及肝腎組織中均未檢測到高濃度的Ni2+存在，與未涂層的NiTi組其 Ni2+含量具有顯著差異，結(jié)果表明 Ti和TiNb 涂層可成功屏蔽 Ni 元素，減少或阻止了鎳離子的釋放。所以經(jīng)表面修飾后可有效提高 NiTi 合金的生物安全性。

當(dāng)非生物活性植入體植入生物體時，會發(fā)生一系列反應(yīng)，最后由膠原纖維包圍植入體形成纖維囊，對植入體周圍纖維囊結(jié)構(gòu)和厚度的觀察便成為評價生物相容性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10-11]。

影響植入體周圍纖維囊厚度因素很多，如活動狀況，植入位置，表面性質(zhì)、形貌、外科植入過程、測量方法等[12-14]，大多數(shù)學(xué)者采用光學(xué)顯微鏡下測量，但制作過程容易產(chǎn)生誤差。有研究資料表明，棱角處纖維囊由于受植入體磨損較為嚴(yán)重，可能較其他處增厚，所以本實(shí)驗(yàn)取材時預(yù)以避開。植入體背側(cè)由于有豐厚的纖維膜覆蓋，可能影響纖維囊的觀察，本試驗(yàn)取材時也預(yù)以避開，而取深方肌肉及附近纖維囊。此外，組織的固定，系列脫水過程都可能與標(biāo)本的滲透壓不同，使纖維囊厚度發(fā)生變化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，對不同組別植入體，在同一條件下對纖維囊厚度進(jìn)行對比研究，對評價生物相容性更有價值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果按《評價》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)（合格）：植入 180 或 360 d 后兩種反應(yīng)均≤ I 級，且每一期試樣組織學(xué)觀察，反應(yīng)程度超過標(biāo)準(zhǔn)一級的片子數(shù)不得多于總數(shù)的1/4。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，大體觀察，植入體周圍未見明顯水腫，滲出，肌肉色澤、形態(tài)正常。組織學(xué)觀察，三組植入體均屬組織學(xué) I 級，即三組植入體大體觀察和組織學(xué)觀察均具有良好的組織學(xué)相容性，和某些學(xué)者觀察結(jié)果一致[15-17]。FCAI結(jié)構(gòu)以 TiNb組最佳，結(jié)構(gòu)疏松，且于FCAI 內(nèi)可見大量毛細(xì)血管生成。FCAI 厚度，NiTi組＞30 μm，沒有達(dá)到 I 級標(biāo)準(zhǔn)，其余兩組均＜30 μm。FCAI 厚度統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，NiTi組和Ti 涂層組、NiTi組和TiNb 涂層組FCAI 差異極顯著，Ti 涂層組和TiNb 涂層組差異不顯著。結(jié)果表明，NiTi組生物相容性欠佳，其余兩組生物相容性較好，但兩組間無顯著差異。

Ti 或 TiNb 涂層可有效防止 NiTi 記憶合金表面 Ni2+釋放，提高 NiTi 合金的生物相容性和安全性，為記憶合金在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供可能。

[1]Li YB, Sun MX, Lu SB.Study on separation of Ni2+ of Nitinol modified on its surfaces by the coating of titanium or titanium-niobium alloy.Acad J PLA Postgrad Med Sch, 2006, 27(3):167-169.(in Chinese)李永濱, 孫明學(xué), 盧世璧.鎳鈦合金表面鈦、鈦鈮涂層防止Ni2+析出實(shí)驗(yàn)研究.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報, 2006, 27(3):167-169.

[2]Li YB, Sun MX, Lu SB.Surface coating of Nitinol of titanium or titanium-niobium alloy to prevent separation of Ni2+ in vivo.Orthop J China, 2005, 13(23):1810-1812.(in Chinese)李永濱, 孫明學(xué), 盧世璧.鎳鈦合金鈦與鈦鈮涂層防止 Ni2+析出的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.中國矯形外科雜志, 2005, 13(23):1810-1812.

[3]Wang AY, Peng J, Zhang X, et al.Experimental study of recovery force of surface-modified TiNi memory alloy rod.J Biomed Eng,2006, 23(4):774-777.(in Chinese)汪愛媛, 彭江, 張晛,等.表面改性TiNi記憶合金棒的回復(fù)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2006, 23(4):774-777.

[4]Hao HP, Xi TF, Bu CS.Supervise and assessment of medical apparatus and instruments.Beijing: China Medical Science And Technology Press, 2000:122-174.(in Chinese)郝和平, 奚廷斐, 卜長生.醫(yī)療器械監(jiān)督管理和評價.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2000:122-174.

[5]Starosvetsky D, Gotman I.Corrosion behavior of titanium nitride coated Ni-Ti shape memory surgical alloy.Biomaterials, 2001, 22(13):1853-1859.

[6]Hornez JC, Lefèvre A, Joly D, et al.Multiple parameter cytotoxicity index on dental alloys and pure metals.Biomol Eng, 2002, 19(2-6):103-117.

[7]Johansson CB, Albrektsson T.A removal torque and histomorphometric study of commercially pure niobium and titanium implants in rabbit bone.Clin Oral Implants Res, 1991, 2(1):24-29.

[8]Naganawa T, Ishihara Y, Iwata T, et al.In vitro biocompatibility of a new titanium-29niobium-13tantalum-4.6zirconium alloy with osteoblast-like MG63 cells.J Periodontol, 2004, 75(12):1701-1707.

[9]Sittig C, Textor M, Spencer ND, et al.Surface characterization of implant materials c.p.Ti, Ti-6Al-7Nb and Ti-6Al-4V with different pretreatments.J Mater Sci Mater Med, 1999, 10(1):35-46.

[10]Laing PG, Ferguson AB Jr, Hodge ES.Tissue reaction in rabbit muscle exposed to metallic implants.J Biomed Mater Res, 1967, 1(1):135-149.

[11]Park JB.Tissue response to implants.New York: Plenum Press, 1984:171-191.

[12]Ansbacher L, Nichols MF, Hahn AW.The influence of Encephalitozoon cuniculi on neural tissue responses to implanted biomaterials in the rabbit.Lab Anim Sci, 1988, 38(6):689-695.

[13]Barone FE, Perry L, Keller T, et al.The biomechanical and histopathologic effects of surface texturing with silicone and polyurethane in tissue implantation and expansion.Plast Reconstr Surg, 1992, 90(1):77-86.

[14]Taylor SR, Gibbons DF.Effect of surface texture on the soft tissue response to polymer implants.J Biomed Mater Res, 1983, 17(2):205-227.

[15]Castleman LS, Motzkin SM, Alicandri FP, et al.Biocompatibility of nitinol alloy as an implant material.J Biomed Mater Res, 1976, 10(5):695-731.

[16]Wang JF, Lu SB, Xu SQ, et al.Experimental report of nitinol alloy embedding in animal tissues.Beijing Biomed Eng, 1992, 11(2):84-87.(in Chinese)王繼芳, 盧世璧, 徐仕琦,等.鈦鎳合金動物組織埋藏實(shí)驗(yàn)報告.北京生物醫(yī)學(xué)工程, 1992, 11(2):84-87.

[17]Ryh?nen J, Kallioinen M, Tuukkanen J, et al.In vivo biocompatibility evaluation of nickel-titanium shape memory metal alloy: muscle and perineural tissue responses and encapsule membrane thickness.J Biomed Mater Res, 1998, 41(3):481-488.