bBMP 異位誘導(dǎo)成骨的組織學(xué)長期觀察

李丹，畢龍，劉民，金靜，呂榮，王軍，白建萍，吳拮，李靜，劉崟，胡蘊玉

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的作用最為肯定的骨誘導(dǎo)因子。自1965年Urist[1]首次報道骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有異位成骨能力后，關(guān)于BMP的研究和應(yīng)用就從未停止，無論是從生物提取 BMP 到基因重組人BMP，還是從動物實驗到臨床應(yīng)用均取得了巨大的成功。但是，關(guān)于BMP 仍有許多沒有解決的問題，例如 BMP 活性定量，BMP 異位成骨的轉(zhuǎn)歸等。目前，研究主要集中在基因重組的BMP，如rhBMP-2、rhBMP-4 及rhBMP-7等，反而忽視對最早通過生物化學(xué)方法提取并純化的天然 BMP的研究。既然 BMP 具有強大的異位骨誘導(dǎo)成骨能力，這種異位生成骨是否具有應(yīng)用價值？其轉(zhuǎn)歸如何？本實驗就小牛骨中生物提取 BMP 異位成骨過程中組織學(xué)的變化進行長期觀察，了解成骨骨質(zhì)變化情況，探討這種異位生成骨進一步應(yīng)用的可能性，并為BMP 相關(guān)骨修復(fù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 bBMP 由本研究所綜合骨庫制備[2]；速眠新為長春軍事獸醫(yī)研究所提供；戊二醛（進口分裝）為上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站提供；染色液為本研究所骨科實驗室（全軍重點實驗室）病理室配制。

1.1.2 儀器 Leica 1516 切片機和Leica DM LA型顯微照相系統(tǒng)均為德國 Leica公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 昆明小鼠，雄性，6周齡，體重（20±2）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，質(zhì)量合格證號：SCXK（軍）2007-007。

1.2 方法

1.2.1 植入實驗 昆明小鼠 21只，麻醉后于雙側(cè)股部肌肉中直接植入塊狀 bBMP 各 2 mg，分別于第 1、2、4、6、8、10、12周各處死 3只，切取誘導(dǎo)分化組織，5% 戊二醛固定。

1.2.2 組織切片與染色 固定的標(biāo)本常規(guī)方法石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度 5 μm，分別行甲苯胺藍染色，HE 染色，麗春紅三色染色。

2 結(jié)果

bBMP 植入 1周，甲苯胺藍染色和HE 染色均顯示大量分化良好的間充質(zhì)細胞、幼稚軟骨細胞及成熟的肥大軟骨細胞生成，分化組織形成一橢圓形組織塊，甲苯胺藍染色顯示軟骨基質(zhì)呈典型的藍紫色（圖 1A）；植入 2周，大量骨小梁生成，骨小梁中散在分布大量成骨細胞，骨小梁呈不規(guī)則的條索狀，中軸部分尚殘存軟骨基質(zhì)，周邊部分為新生的類骨質(zhì)或骨質(zhì)，HE 染色呈粉紅色（圖 2B），麗春紅三色染色顯示骨小梁新生的骨組織類骨質(zhì)呈深藍色，未見染成紅色的成熟骨質(zhì)（圖 3B），甲苯胺藍染色軟骨基質(zhì)淡染；植入 4周，骨小梁轉(zhuǎn)化為成熟的骨質(zhì)（圖 2C，圖 3C），骨細胞及骨陷窩形成，甲苯胺藍染色顯示軟骨基質(zhì)的藍紫色失染，表明軟骨化骨，已無軟骨基質(zhì)分泌；骨小梁間有骨髓腔和骨髓樣物質(zhì)形成；從 4周開始骨質(zhì)中有散在于骨細胞中的破骨細胞出現(xiàn)；植入 6～12周，橢圓形骨組織塊內(nèi)部小梁骨逐漸吸收、斷裂、不連接，但外周骨質(zhì)逐漸塑形，骨細胞層狀排列，麗春紅三色染色顯示紅色骨質(zhì)周邊有藍色的新生骨形成（圖 3E、F、G）。

圖1 1～12周 bBMP 異位誘導(dǎo)成骨情況的甲苯胺藍染色×200 圖 2 1～12周 bBMP 異位誘導(dǎo)成骨情況的HE 染色觀察×100 圖 3 1～12周 bBMP 異位誘導(dǎo)成骨情況的麗春紅三色染色×200Figure1 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP toluidine blue-stained×200 Figure 2 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP hematoxylin and eosin-stained×100 Figure 3 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP Masson trichrome-stained×200

3 討論

BMP是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）超家族成員，廣泛分布于動物骨組織，是一種酸性糖蛋白。現(xiàn)已在人基因組中發(fā)現(xiàn) BMP 家族有 20 多個成員，是已知的所有生長因子中對骨的形成作用最強的生長因子，對骨組織的形成、骨的生長及骨損傷修復(fù)具有促進作用[3]?，F(xiàn)有的研究大多集中在BMP 對骨修復(fù)的促進方面，與某些材料復(fù)合或作為構(gòu)建組織工程骨必不可少的生長因子。之所以學(xué)者們熱衷于此，正是因為骨移植替代物的短缺或者美中不足，即使臨床已經(jīng)應(yīng)用的替代物如自體骨、異體骨及各種人工骨和一些初步臨床應(yīng)用的個體化設(shè)計的組織工程骨均不同程度存在諸如取骨量有限、存在潛在病毒感染、免疫排斥反應(yīng)、新骨形成和材料降解不匹配等諸多問題。因此，有學(xué)者開始考慮能否利用 BMP 異位骨誘導(dǎo)作用將異位生成骨用于骨移植[3-5]。

Kusumoto等[6]以 I 型膠原為rhBMP-2 載體在Wistar 大鼠肌肉中異位預(yù)制了血管化的骨組織，Inoda等[7]以膠原海綿為rhBMP-2 載體于Wistar 大鼠肌肉中異位構(gòu)建骨組織，3周時用于修復(fù)骨缺損，并與自體骨、異體骨進行了比較，實驗結(jié)果令人滿意。然而 Cooley等[8]對 rhBMP-2 異位成骨進行的長期觀察研究表明，這種皮下或肌肉注射 rhBMP-2 所誘導(dǎo)生成的異位骨與在骨性組織中長期存在的新生骨不同，異位成骨是短期成骨，異位新生骨會發(fā)生吸收，在4周時完全喪失鈣化特征，在其設(shè)計的9組實驗中，除 4組皮瓣組外，其他 5組新生骨在4～5周時均全部消失。本實驗直接將從小牛皮質(zhì)骨中提取的天然 BMP（二次純化離心所得的塊狀沉淀）未加任何載體，單獨植入小鼠股部肌肉中發(fā)現(xiàn)，如 rhBMP-2 一樣，1周時即誘導(dǎo)大量軟骨細胞生成，2周時大量骨小梁生成，不同的是，因塊狀 bBMP 向四周募集間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化從而形成一不規(guī)則的橢圓形組織塊；4周時，bBMP 所誘導(dǎo)的異位橢圓形骨組織最外層骨小梁塑形連接轉(zhuǎn)化為成熟骨質(zhì)，骨細胞及骨陷窩形成，甲苯胺藍染色顯示軟骨基質(zhì)的藍紫色失染，表明軟骨化骨，已無軟骨基質(zhì)分泌，內(nèi)部骨小梁雖也由新生骨轉(zhuǎn)化為成熟骨質(zhì)，但骨小梁不如 2周時致密，6～12周，橢圓形組織塊內(nèi)部仍殘存部分骨小梁，但明顯稀疏、斷裂、不連接，外層骨質(zhì)卻未見明顯吸收。

Jingushi等[9]以 βTCP 作為rhBMP-2 載體在體內(nèi)肌肉中異位構(gòu)建血管化的自體骨，結(jié)果表明，血管化在異位骨的形成和維持中起著至關(guān)重要的作用。本實驗橢圓形組織塊內(nèi)骨小梁在4周以后開始吸收，而周邊骨質(zhì) 12周時仍未見有明顯吸收，相反，骨質(zhì)塑形，骨小梁周邊仍可見到新生骨生成。本實驗直接異位植入塊狀 bBMP，誘導(dǎo)形成的橢圓形組織塊外周被肌肉所包繞，有著豐富的血供，骨質(zhì)未見明顯吸收，而組織塊內(nèi)部，由于沒有載體支架，血管長入困難，血供差，骨小梁逐漸吸收降解，提示血供在異位骨的形成和維持中可能起著重要作用，后續(xù)實驗將進一步探討血管化和血供在bBMP 異位成骨中的作用。

bBMP 無需任何載體即可在肌肉中異位成骨，通過軟骨化骨成骨，骨質(zhì)在血供充分的外周未見明顯降解吸收，提示 bBMP 異位成骨存在潛在的應(yīng)用價值。

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