誘導性多能干細胞的研究進展及應用前景

林曉龍，姜樺，陳彤

干細胞治療被認為是21 世紀治療人類疾病最理想的模式。根據(jù)分化潛能的不同，干細胞可以分為全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞；根據(jù)來源的不同，干細胞可分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES 細胞）和成體干細胞。經(jīng)過幾十年的研究，科學家在 ES 細胞分離、純化、體外培養(yǎng)、遺傳操作等方面已積累了相當豐富的經(jīng)驗，目前可通過囊胚內(nèi)細胞團分離、核轉(zhuǎn)移、細胞融合等多種方法獲得ES 細胞，ES 細胞所具有的多向分化潛能和無限增殖的能力使它擁有廣闊的基礎及臨床應用前景。但是，ES 細胞建系過程中需要破壞受精卵或囊胚，在許多國家和民族的宗教信仰中，受精卵或囊胚即是生命，因此，倫理問題成為胚胎干細胞研究無法逾越的障礙；此外，從 ES 細胞中獲得的功能細胞對患者來說屬于異體細胞，細胞治療時的免疫排斥問題也阻礙了它的臨床研究進展；加上細胞培養(yǎng)過程的繁瑣、定向分化能力的非可控性等問題迫使科學家尋找其他更合適的方法得到更符合病人需要的多能干細胞。在這種背景下，誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS 細胞）誕生了。它在應用潛能方面顯示出無比優(yōu)越性。本文就誘導性多能干細胞產(chǎn)生的歷史、研究進展及應用前景做一綜述。

1 iPS 細胞的產(chǎn)生方法

1.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

2006 年日本科學家 Takahashi 和Yamanaka[1]首次在Cell 雜志上報道通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將 4 個轉(zhuǎn)錄因子即 Oct3/4、Sox2、c-Myc 及 Klf4 導入小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）獲得一種多能干細胞，并命名為誘導性多能干細胞。隨后，Takahashi等[2]和Yu 等[3]也分別獲得人成纖維細胞（human fibroblast，HF）來源的 iPS 細胞。目前，可以從神經(jīng)祖細胞[4]、肝細胞[5]、胃黏膜上皮細胞[5]、人精原干細胞[6]、頭發(fā)角質(zhì)細胞[7]中獲得 iPS 細胞。這些初始細胞分別代表三個胚層來源的分化細胞，表明從不同組織來源的體細胞都能產(chǎn)生 iPS 細胞。這種現(xiàn)象并不限于某個胚層發(fā)育形成的組織[4]。最初的基因圖譜分析顯示 iPS 細胞基因組存在病毒插入位點[1]，但不明確這些插入位點是否是誘導所必需的。隨后，利用不與宿主基因整合的腺病毒[8]、質(zhì)粒[9]表達載體瞬時轉(zhuǎn)染靶細胞也可以獲得 iPS 細胞。這些研究尤其是后者更直接證明病毒基因插入突變不是誘導所必需的。由于質(zhì)粒本身為異源性的 DNA，反復多次轉(zhuǎn)染不能排除靶細胞基因組突變的可能，因此，無細胞毒副作用的小分子化合物似乎是更為安全的載體。Kim 等[10]使用一種融合了上述四種轉(zhuǎn)錄因子的細胞滲透蛋白（cell penetrating peptide，CPP）直接誘導 HF 細胞為 iPS 細胞。雖然利用腺病毒和質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染體系降低了插入致瘤突變的危險性，但是誘導效率極低。腺病毒也仍存在病毒的污染，目前尚未成功用于人的 iPS 細胞系的建立。

1.2 轉(zhuǎn)基因剔除技術(shù)

雖然現(xiàn)在可以不使用病毒載體、c-Myc[11]就能獲得 iPS細胞，但仍然需要 Oct4 或 Klf4。研究發(fā)現(xiàn)兩者具有潛在的致細胞異常增生作用[12-13]，這種細胞用于臨床治療是不安全的。因此科學家嘗試利用轉(zhuǎn)基因剔除技術(shù)建立無外緣基因持續(xù)表達的 iPS 細胞系。Kaji 等[14]利用 c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2、2A 多肽的多蛋白質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 MEF 細胞獲得 iPS 細胞后進一步用表達 Cre-重組酶的瞬時轉(zhuǎn)染體系剔除插入的外緣基因。另一種方法是利用 PB（PiggyBac）轉(zhuǎn)座子——轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)。PB 是來自飛蛾的一種常見轉(zhuǎn)座子，可在人等哺乳動物的細胞株中高效導入基因并穩(wěn)定表達[15]。Woltjen 等[16]和Yusa 等[17]兩個獨立研究小組分別利用 PB轉(zhuǎn)座子將 c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2 四個基因?qū)?MEF、HF 細胞獲得 iPS 細胞后通過表達轉(zhuǎn)座酶將外緣性基因剔除，再進一步經(jīng)過篩選獲得轉(zhuǎn)基因剔除的 iPS 細胞?；驁D譜分析表明剔除后的基因組與原先未轉(zhuǎn)染時的一致，未留下可發(fā)覺的痕跡。誘導效率為 0.1%～1%，與逆病毒一致，比腺病毒和質(zhì)粒載體系統(tǒng)明顯提高。但是這種系統(tǒng)也存在問題，驗證基因組不存在外緣插入基因的過程十分繁瑣，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在基因剔除后轉(zhuǎn)座酶識別位點發(fā)生基因重排現(xiàn)象。

2 iPS 細胞的重編程機制

2.1 轉(zhuǎn)錄因子

c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2 是最常用的轉(zhuǎn)錄因子，都可以成功誘導鼠和人源性體細胞為 iPS 細胞。Nanog 和Lin-28是Yu等建立人源性 iPS 細胞使用的另外兩個轉(zhuǎn)錄因子。Takahashi 和Yamanaka[1]認為 c-Myc、Klf4、Oct4 和Sox2 四個轉(zhuǎn)錄因子在誘導重編程方面起到重要作用，但并不是維持 iPS 增殖的必需因子，相反，這些因子的高水平表達不利維持 iPS 細胞的自我更新。Nakagawa 等[11]僅利用 Klf4 和Oct4 兩種轉(zhuǎn)錄因子就能誘導神經(jīng)祖細胞為多能干細胞，表明 c-Myc 不是細胞核重編程所必需的。后來Kim 等[18]僅使用 Oct4 一種轉(zhuǎn)錄因子也成功誘導神經(jīng)祖細胞為 iPS 細胞，去除了具有致細胞異常增生作用的 c-Myc和Klf4。之所以有這種可能，是因為這些神經(jīng)祖細胞比胚胎干細胞表達更高水平的內(nèi)生 Sox2 和c-Myc，這說明具有適當匹配的轉(zhuǎn)錄因子的體細胞是生成 iPS 細胞的一個潛在有用的起始點。另外，表觀遺傳學發(fā)現(xiàn) iPS 細胞基因組中那些位于開放結(jié)構(gòu)狀態(tài)的染色質(zhì)上的基因?qū)ν庠崔D(zhuǎn)錄因子反應更敏感，而甲基化的基因反應遲緩[19]。與此研究發(fā)現(xiàn)一致的是，添加組蛋白去乙?；种苿20]、DNA 甲基化抑制劑[21]可以提高 iPS 細胞誘導效率。

2.2 插入突變

最初 Takahashi 和Yamanaka[1]發(fā)現(xiàn)每個 iPS 細胞克隆基因組中都含有大約 20 個病毒插入位點，因此猜測這些插入位點可能誘導某些基因表達的開啟或關閉，這種插入突變可能是誘導所必需的。Aoi 等[5]也發(fā)現(xiàn)基因組確實存在病毒插入位點，但是在所獲得的所有 iPS 細胞中插入位點并不完全一致。利用腺病毒和質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)更直接證明插入突變不是誘導所必需的。但是后者需要進行反復多次轉(zhuǎn)染，所以也不能完全排除在誘導和重編程過程中基因組發(fā)生改變的可能性。

3 iPS 細胞的多向分化潛能

多向分化潛能是干細胞的一個特征，也是對 ES、iPS 等細胞進行干細胞特征鑒定的一個重要指標。目前鑒定細胞是否具有三胚層分化能力的方法主要通過體外培養(yǎng)形成擬胚體和免疫缺陷鼠體內(nèi)接種形成畸胎瘤等方法[22]。實驗證實目前建立的鼠源和人源 iPS 細胞都具有擬胚體和畸胎瘤形成能力。而且，和ES 細胞一樣，在特定誘導條件下可以進一步分化為特定的細胞。至今，已經(jīng)成功誘導 iPS 細胞分化為平滑肌細胞[23-24]、造血細胞[24-26]、血管內(nèi)皮細胞[24-26]、淋巴管內(nèi)皮細胞[25]、心肌細胞[24-25,27]、成骨細胞[28]、脂肪細胞[28-29]、樹突細胞[30]、巨噬細胞[30]、運動神經(jīng)元[31]、聽覺螺旋神經(jīng)元[32]。初始細胞不僅可以是正常的體細胞，還可以是遺傳性基因組缺陷性細胞。將罹患 Fanconi 貧血病患者的 HF 細胞利用基因打靶技術(shù)糾正其異常核型后誘導為 iPS 細胞，并進一步分化為具有正常核型的髓系和紅系造血主細胞[33]。這些自體來源的 iPS 細胞在自體干細胞移植方面顯示出巨大的臨床應用價值。

4 應用前景

4.1 建立疾病模型

Hanna等[34]將 iPS 細胞分化得到的造血祖細胞結(jié)合基因打靶技術(shù)移植入鐮狀細胞貧血模型的小鼠體內(nèi)，糾正了異常鐮形血紅蛋白。至今已建立來自罹患遺傳性疾病的病人 iPS 細胞[35]，包括腺苷脫氨酶-重癥聯(lián)合免疫缺陷?。ˋDA-SCID）、Shwachman-Bodian-Diamond 綜合征、三型高雪病（gaucher disease type III）、進行性肌營養(yǎng)不良癥（duchenne & becker muscular dystrophy）、帕金森?。≒arkinson disease）、亨廷頓?。℉untington disease）、1 型糖尿?。↗uvenile diabetes mellitus）、唐氏綜合征（Down Syndrome）及 Lesch-Nyhan 綜合征等。通過體外研究這些疾病特異性的 iPS 細胞，有助于間接推斷疾病的發(fā)病機制及尋找有效的治療措施。

4.2 研究人類發(fā)育生物學及新基因的發(fā)現(xiàn)

由于 ES 細胞來源的限制，人們對自生胚胎發(fā)育機制、增殖分化及調(diào)控、細胞識別誘導、組織及器官構(gòu)建、畸變等問題尚未找到答案。而 iPS 細胞與 ES 細胞在生長條件、細胞表型、細胞的多能分化特性等許多方面有相似點，在一定程度上它可以代替 ES 細胞擔任基礎研究及臨床應用角色。iPS 細胞體外自發(fā)分化的擬胚體可以模擬胚胎發(fā)育過程，可以作為組織、器官發(fā)生、發(fā)育研究的模型，彌補完整人胚不能用于這方面研究的缺陷。利用某些手段如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、體外導入報告標志基因、基因打靶技術(shù)、致畸試驗、iPS細胞特化的細胞植入動物胚胎或成體動物中還可用于某一特定基因在形態(tài)及功能的整合等方面的研究。

4.3 自體干細胞移植

不依靠人工或捐獻者的器官，憑借本人強大的自然治愈能力讓喪失功能的器官再生是最理想的治療方式。對于遺傳性疾病，利用自體成體細胞建立 iPS 細胞，通過基因打靶技術(shù)糾正遺傳性缺陷基因，再誘導分化為特化細胞進行移植。動物實驗證明自體 iPS 細胞移植可以治療鐮狀細胞貧血[33]、急性心肌缺血[36]。由于 iPS 細胞成瘤性問題尚未解決，目前還不能在人體開展臨床試驗，需要在動物實驗中進一步積累 iPS 細胞移植治療的經(jīng)驗。

4.4 新藥發(fā)現(xiàn)及篩選

目前新藥的藥理、藥代學、毒理學、藥效學等細胞水平的研究及生物學模型，大都在其他種屬的細胞系進行。然而異種細胞與人之間畢竟有不完全相同的藥物反應。而患者及疾病特異性源性 iPS 細胞的建立可以實現(xiàn)在體外以人源細胞為對象的試驗性用藥，觀察藥物對其基因結(jié)構(gòu)及表達的影響，間接判斷該藥物對某種疾病的療效，這是一種全新探索及篩選藥物治療的模式。Yokoo 等[37]初步比較了不同的抗心律失常藥對分別由 ES、iPS 細胞分化來的心肌細胞的收縮頻率、強度的影響，發(fā)現(xiàn)兩者無顯著差別，且和臨床經(jīng)驗用藥的結(jié)果一致，表明經(jīng)體外進行藥物療效的預實驗，可篩選出針對個體有效的藥物。這將對臨床用藥產(chǎn)生巨大的改革作用。

5 目前存在的問題及展望

5.1 重編程機制

如上所述，目前已經(jīng)可以不用病毒介導轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得iPS 細胞，表明病毒插入突變不是必需的。對于轉(zhuǎn)錄因子，則意見不一。沒有 c-Myc 參與或只用 Oct4 因子也可以獲得 iPS 細胞[11,18]，但是其采用的初始細胞是已表達高水平某些轉(zhuǎn)錄因子的神經(jīng)祖細胞，所以也不能完全排除對轉(zhuǎn)錄因子的依賴性。

5.2 誘導效率

此前報道 iPS 細胞誘導效率不到 0.1%[38]，效率太低阻礙了對重編程機制的研究，也阻礙了 iPS 細胞進一步發(fā)揮其應用價值，因此提高誘導效率的研究勢在必行。添加SV40 大 T 抗原將轉(zhuǎn)染效率提高了 23～70 倍[39]；添加強力霉素提高了至少 100 倍[40]。PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率與病毒系統(tǒng)無差異。Sall 4（Sal-like 4）也是胚胎干細胞相關轉(zhuǎn)錄單位之一[41]。添加轉(zhuǎn)錄因子Sall 4 比單用 Oct3/4、Sox2、Klf4 誘導效率提高了 10 倍。使用基因敲除技術(shù)敲除 Sall 4 后誘導效率顯著降低[42]，但仍不明確 Sall 4 是否可被同組蛋白 Sall 1 或其他因子取代。降低培養(yǎng)環(huán)境的氧氣溶度可以提高誘導效率，在 5% O2培養(yǎng)下效率可達0.40%，聯(lián)合使用 I 型組蛋白去乙?；敢种苿?Valproic Acid（VPA）效率可達 0.48%[43]，但何種氧氣溶度以及在低氧環(huán)境下培養(yǎng)多長時間最為合適仍不明確。

5.3 致瘤性

iPS 細胞誘導過程中使用的轉(zhuǎn)錄因子 c-Myc 和Klf4都是癌基因，病毒插入也可以導致腫瘤發(fā)生，而且，未分化iPS 細胞自身尚可在體內(nèi)形成畸胎瘤，因此，iPS 細胞的致瘤性是其進一步推廣應用的一大障礙。雖然現(xiàn)在已經(jīng)可以在沒有 c-Myc、Klf4 和病毒情況下獲得 iPS 細胞，而且隨著細胞的分化，iPS 細胞形成畸胎瘤的能力也逐漸減弱，但關于如何在細胞移植前將混雜在其中的未分化 iPS 細胞去除[44]，以及在何分化階段移植，目前還沒有這方面安全應用的研究報道。

雖然 iPS 細胞距離臨床應用還有一段時間，但伴隨細胞生物學、分子生物學、發(fā)育生物學、功能基因組學以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進一步發(fā)展，iPS 技術(shù)必將在細胞移植治療、藥物篩選和發(fā)病機制研究中發(fā)揮重要作用。

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