免疫原快速激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)研究思路的演變與創(chuàng)新

郭峰

1953 年 Nelson 發(fā)現(xiàn)人類紅細胞可與特異調(diào)理過的梅毒螺旋體及肺炎雙球菌結(jié)合，稱為免疫黏附，并推測紅細胞膜表面可能存在免疫黏附受體，免疫復(fù)合物與該受體結(jié)合可促進白細胞的吞噬作用，是宿主防御機制的一部分。后來證明此黏附受體即為 C3b 受體（CR1、CD35）。隨后，1981 年Siegel 發(fā)現(xiàn)紅細胞具有多種免疫功能，不僅可免疫黏附細菌，而且紅細胞膜中的過氧化物酶等對細菌還具有氧化殺傷作用，并由此提出紅細胞免疫系統(tǒng)的新概念，為補體與補體受體在血液免疫反應(yīng)中的重要性可量化研究提供了依據(jù)。上述研究使人們認識到抗原-抗體免疫復(fù)合物能激活補體系統(tǒng)，進而引發(fā)補體裂解片段調(diào)理致病原與紅細胞表面 CR1 黏附，具有向白細胞傳遞致病原信息以及參與白細胞免疫反應(yīng)的重要作用，開拓了血液免疫反應(yīng)中紅細胞天然免疫功能與白細胞固有和適應(yīng)性免疫功能之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究的新領(lǐng)域[1]。1982 年，我們在國內(nèi)首開紅細胞天然免疫研究工作，驗證了 Siegel等的研究工作的真實性與科學(xué)性，我們的研究表明紅細胞免疫黏附能力的高低與免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡）和腫瘤患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[2]。進而在此研究思路上我們還有所創(chuàng)新，創(chuàng)建了免疫原快速激活血細胞固有免疫反應(yīng)的體外實驗研究體系，為現(xiàn)代系統(tǒng)血液免疫學(xué)研究提供了扎實的實驗研究基礎(chǔ)。本文對血液免疫研究思路的演變歷程進行回顧，希望對現(xiàn)代系統(tǒng)血液免疫學(xué)的創(chuàng)建與開拓能有所幫助。

1 系統(tǒng)血液免疫學(xué)創(chuàng)新的源頭

Siegel 利用經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)的原理，設(shè)計了人紅細胞免疫功能測定的綿羊紅細胞花環(huán)實驗，主要程序是用綿羊紅細胞免疫兔從而產(chǎn)生兔抗羊紅細胞抗體，滴定效價后，取適量的兔抗羊紅細胞抗體進行孵育，加入亞溶血單位的補體，形成抗羊紅細胞抗體與羊紅細胞和補體相結(jié)合的抗原-抗體-補體復(fù)合物，將此復(fù)合物加至待測人紅細胞懸液中，37 ℃ 作用 30 min，形成羊紅細胞包繞人紅細胞的玫瑰花，以玫瑰花率來判定人紅細胞免疫功能的高低。這種通過抗原-抗體復(fù)合物激活補體經(jīng)典途徑探討紅細胞免疫功能變化與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病關(guān)系的方法，只能認識到紅細胞在清除白細胞免疫反應(yīng)后產(chǎn)生的免疫復(fù)合物方面具有重要作用，卻無法證明紅細胞對補體調(diào)理過的致病原的直接清除作用，對深入研究紅細胞固有免疫功能在血液免疫反應(yīng)中的重要地位具有局限性[3]。酵母菌膜中含有 β-葡萄糖和甘露聚糖，酵母菌可通過旁路和甘露聚糖結(jié)合凝集素 MBL 途徑激活補體，直接形成抗原-補體復(fù)合物，這種被調(diào)理而附有補體的致病原可與紅細胞表面 C3b 受體（CR1、CD35）相結(jié)合。我們用酵母菌取代綿羊紅細胞，建立了紅心蘭瓣的酵母菌花環(huán)實驗，結(jié)果顯示致病原進入血液中首先激活了補體系統(tǒng)，被補體調(diào)理后的抗原可直接遞呈給紅細胞處理，證明在白細胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體前，紅細胞就可直接參與補體系統(tǒng)對致病原的調(diào)理作用[2]；實驗還表明細菌可直接通過旁路和MBL 途徑激活補體系統(tǒng)和紅細胞固有免疫系統(tǒng)，可直接被補體和紅細胞識別、滅活和清除，這是系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)的重要組成部分[4]，致病原不需要通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)即可被清除。酵母多糖直接激活補體系統(tǒng)后能與紅細胞表面CD35 分子免疫黏附形成花環(huán)，后來我們發(fā)現(xiàn)癌細胞膜中也含有多糖，同樣可通過旁路和MBL 途徑直接激活補體系統(tǒng)，與紅細胞和白細胞補體受體免疫黏附形成花環(huán)，因此我們建立了腫瘤紅細胞花環(huán)、腫瘤淋巴細胞花環(huán)和腫瘤粒細胞花環(huán)，分別作為紅細胞固有免疫活性、淋巴細胞固有免疫活性、粒細胞固有免疫活性的強弱指標，用來研究血細胞固有免疫黏附活性與淋巴細胞適應(yīng)性免疫活性之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，具有重要的實用價值。血細胞固有免疫黏附活性高低與 CR1 基因型密切相關(guān)，高表達型花環(huán)率高，低表達型花環(huán)率低[5]，酵母菌花環(huán)和腫瘤花環(huán)實驗的推廣與應(yīng)用對我國紅細胞固有免疫功能與其他血細胞固有免疫功能及適應(yīng)性免疫功能之間網(wǎng)絡(luò)機制的研究具有重要貢獻。但這些實驗方法的創(chuàng)立都是還原法的研究思路，需分離出被研究的血細胞，棄除其他血細胞，而不是系統(tǒng)免疫學(xué)的研究方法，這些方法用于研究不同血細胞免疫功能之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系還具有局限性。因此，為了使實驗研究方法更客觀、更自然和更科學(xué)，必須以系統(tǒng)論研究思路改良花環(huán)實驗。

2 系統(tǒng)血液免疫學(xué)方法學(xué)新的研究領(lǐng)域的開拓

我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞（包括肝癌細胞、Hela 細胞、小鼠艾氏腹水癌 S180 細胞傳代株等）可直接快速激活補體系統(tǒng)，被補體分子調(diào)理的腫瘤細胞絕大多數(shù)被紅細胞免疫黏附，紅細胞花環(huán)率占總花環(huán)數(shù)的99%，而白細胞和血小板黏附腫瘤細胞形成的花環(huán)率只占 1%。血細胞對腫瘤細胞免疫黏附反應(yīng)的表現(xiàn)形式只有一種，即血細胞包繞腫瘤細胞形成花環(huán)狀。酵母菌的體積要小于腫瘤細胞，如果用酵母菌取代腫瘤細胞，酵母菌比紅細胞和白細胞小，因此各種血細胞對酵母菌的固有免疫反應(yīng)可表現(xiàn)出多種形式：①免疫黏附形式，一個紅細胞可免疫黏附一個或多個酵母菌；②粒細胞對酵母菌的固有免疫反應(yīng)可為吞噬或免疫黏附；③淋巴細胞和血小板對酵母菌的固有免疫反應(yīng)的主要表現(xiàn)形式與紅細胞類同，以固有免疫黏附為主[6]。我們將酵母菌加入全血中 37 ℃ 作用 30 min 后，結(jié)果顯示還是紅細胞黏附占多數(shù)，粒細胞吞噬以及淋巴細胞、血小板黏附比例均較小，這種發(fā)現(xiàn)為以后創(chuàng)立系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)、紅細胞固有（天然）免疫反應(yīng)主干道假設(shè)與理論奠定了實驗基礎(chǔ)。而將分離法花環(huán)實驗與系統(tǒng)論花環(huán)法相結(jié)合，形成自然與分離花環(huán)實驗免疫研究體系也是一個重大創(chuàng)新。我們用全血腫瘤花環(huán)實驗和分離法的腫瘤紅細胞花環(huán)、腫瘤淋巴細胞花環(huán)、腫瘤粒細胞花環(huán)實驗相結(jié)合，研究原發(fā)性肝癌患者血細胞固有免疫反應(yīng)變化與正常人之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者全血細胞腫瘤花環(huán)率與分離法的腫瘤紅細胞花環(huán)率、腫瘤淋巴細胞花環(huán)率、腫瘤粒細胞花環(huán)率都明顯低于正常人，表明原發(fā)性肝癌患者系統(tǒng)血液快速固有免疫黏附反應(yīng)低下，這種變化與血液固有免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系值得我們?nèi)ニ伎己蛣?chuàng)新；此外，我們還設(shè)計了滅活補體活性的 ETDA 抗凝與不滅活補體活性的枸櫞酸抗凝血對比花環(huán)實驗，發(fā)現(xiàn) EDTA 抗凝血組血細胞包繞黏附腫瘤細胞花環(huán)率明顯下降，表明補體系統(tǒng)的激活是花環(huán)形成的必需條件[7]。不論腫瘤細胞與紅細胞補體受體黏附，還是與淋巴細胞補體受體和粒細胞補體受體黏附形成花環(huán)，腫瘤細胞都必須首先激活補體系統(tǒng)，腫瘤細胞被補體調(diào)理后才能被各種血細胞表面的補體受體捕獲，并誘發(fā)進一步的免疫炎癥反應(yīng)，這是一種系統(tǒng)的血細胞固有免疫黏附反應(yīng)。血細胞與腫瘤細胞固有免疫黏附后分子水平的變化規(guī)律，需要構(gòu)建系統(tǒng)論與還原論相結(jié)合的系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)的實驗研究體系進行深入研究，而這種靈感與思路，隨而構(gòu)成了現(xiàn)代系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)的體外實驗研究體系。

3 現(xiàn)代系統(tǒng)血液免疫學(xué)研究領(lǐng)域的戰(zhàn)略性突破

經(jīng)過對測定紅細胞固有免疫黏附能力的花環(huán)實驗的改良與創(chuàng)新，利用旁路激活補體原理，建立酵母菌紅細胞花環(huán)、全血細胞腫瘤花環(huán)、腫瘤淋巴細胞花環(huán)、腫瘤粒細胞花環(huán)，我們的研究思路從只研究紅細胞的固有免疫功能，過渡到同時還研究其他血細胞的固有免疫功能。這種研究思路的基本點就是考慮到所有血細胞包括紅細胞、淋巴細胞、粒細胞、血小板表面都有多種補體受體，可與補體調(diào)理過的抗原黏附結(jié)合形成花環(huán)。在研究實踐中，我們會思考一個問題：調(diào)理過的致病原（包括酵母菌、腫瘤細胞）被各種血細胞免疫黏附后會發(fā)生怎樣的后續(xù)變化？血細胞膜各種免疫分子的表達會有什么變化？白細胞分泌的各種細胞因子會有什么變化？血漿中補體系統(tǒng)活化后會有什么變化？這就需要設(shè)計更客觀、更科學(xué)而又簡單的體外實驗免疫研究體系進行驗證與進一步的深入研究[8]。我們首先將一定量的枸櫞酸抗凝血與一定量的免疫原（如酵母菌或小鼠艾氏腹水癌 S180 細胞株）混勻，37 ℃ 水浴 1 h后離心，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測定的 IL-8 含量與對照組（用生理鹽水取代免疫原）相比增加了100 倍以上[9]。表明血細胞不僅可免疫黏附外來的免疫原細胞，而且被外來免疫原物質(zhì)快速激活后，白細胞可釋放細胞因子，并對致病原發(fā)生快速的固有免疫炎癥反應(yīng)，這是一種連鎖的系統(tǒng)血液固有免疫炎癥反應(yīng)。根據(jù) 1 滴血加 1 滴癌細胞混勻37 ℃ 作用 30 min 后，主要表現(xiàn)為紅細胞黏附腫瘤細胞形成花環(huán)的實驗結(jié)果[6]，我們需要弄清楚在有紅細胞與沒有紅細胞 2 種狀態(tài)下，IL-8 等細胞因子的含量變化差異。因此，我們設(shè)計了自然與分離實驗免疫研究體系：包括自然體系實驗組與對照組、分離體系實驗組與對照組。自然體系每管均為枸櫞酸抗凝全血 0.2 ml 和血漿 0.3 ml，實驗組另加免疫原細胞（酵母菌或小鼠艾氏腹水癌 S180 細胞株）0.2 ml，對照組加生理鹽水取代免疫原細胞。分離體系每管均為白細胞懸液（用低溫冰水法除去紅細胞）0.2 ml 和血漿 0.3 ml，實驗組與對照組均與自然體系相同，4組混勻后 37 ℃ 水浴 1 h，測定反應(yīng)液中 IL-8、IL-6 含量。4組都有不同的變化規(guī)律，有紅細胞的自然體系實驗組與對照組的IL-8 與 IL-6 含量都分別低于分離體系實驗組與對照組，說明紅細胞有負調(diào)控 IL-8 和IL-6 的作用；而自然體系實驗組和分離體系實驗組 IL-8、IL-6 含量都比相應(yīng)的對照組含量高，說明免疫原可在體外快速激活血液中白細胞分泌細胞因子 IL-8、IL-6 等[8]。自然與分離體系研究結(jié)果表明免疫原進入血液中可快速激發(fā)系統(tǒng)血液固有免疫炎癥反應(yīng)，而紅細胞在系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)中起著重要的固有免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控作用。我們可以根據(jù)研究目的的不同設(shè)計各種公式，計算免疫原的激活指數(shù)和紅細胞免疫的調(diào)控指數(shù)，利用這種體外實驗免疫研究體系，可發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)中，補體 C3、C4，紅細胞 CD35、CD44、CD55、CD59，白細胞 CD4、CD8、CD25、CXCR4 和白細胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 含量等都有顯著變化，表明我們已建立了免疫原快速激活所有血細胞固有免疫活性的現(xiàn)代系統(tǒng)血液快速固有免疫炎癥反應(yīng)的體外實驗研究體系，這是一大突破與貢獻[10-12]。

4 我國現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)的研究基礎(chǔ)

國外已有系統(tǒng)免疫學(xué)的新概念與新的研究報道。人們已認識到系統(tǒng)免疫學(xué)是最新的現(xiàn)代免疫學(xué)研究領(lǐng)域，其意指在系統(tǒng)生物學(xué)更廣闊的范圍內(nèi)，從客觀存在的復(fù)雜系統(tǒng)工程的角度[13]，對免疫系統(tǒng)的不同子系統(tǒng)與組成之間，各自在免疫原激活系統(tǒng)免疫反應(yīng)中如何發(fā)揮免疫功能，以及對相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制進行公式和數(shù)字化的深入研究。但在國際上，系統(tǒng)免疫學(xué)的概念還僅僅只是指白細胞免疫系統(tǒng)中各子系統(tǒng)（如 T 細胞子系統(tǒng)與 NK 細胞子系統(tǒng)等）與組分之間的復(fù)雜工程的研究[13]。而事實上致病原進入血循環(huán)后，首先通過旁路或 MBL 途徑被血循環(huán)中補體系統(tǒng)等體液性免疫物質(zhì)所識別激活，進而引發(fā)補體系統(tǒng)等體液固有免疫炎癥反應(yīng)。由于 85% 的補體受體 I 型（CR1、CD35）存在于紅細胞膜上，致病原被補體分子調(diào)理后，85% 黏附有補體 C3b 成分的致病原可被紅細胞表面 CD35分子識別、黏附和加工處理，最終遞呈給淋巴細胞，通過淋巴細胞 CD2 和補體受體等多種復(fù)雜機制，激發(fā)淋巴細胞固有免疫和適應(yīng)性免疫炎癥反應(yīng)；而血小板、粒細胞、淋巴細胞等其他血細胞表面也有補體受體以及 CD55、CD59 分子等，因此還有25% 補體調(diào)理后抗原可直接被血小板、白細胞免疫黏附調(diào)理，最終引發(fā)淋巴細胞的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。國外已有報道，HIV 進入血液后，首先被補體識別與調(diào)理，然后被紅細胞表面 C3b 受體（CR1、CD35）免疫黏附處理，將 HIV 分子上 C3b降解為 C3d、C3dg，再遞呈給 B 細胞 CR2 處理，最終遞呈 CD4+ T 細胞，引發(fā) CD4+ T 細胞免疫反應(yīng)并導(dǎo)致發(fā)病[4]，這說明紅細胞固有免疫主干道在系統(tǒng)血液快速固有免疫炎癥反應(yīng)中具有向淋巴細胞傳遞信息和緩沖致病原損害的重要作用。目前國外還沒有體外實驗可驗證致病原引發(fā)系統(tǒng)血液快速固有免疫炎癥反應(yīng)的系統(tǒng)免疫學(xué)測定方法，因此我們構(gòu)建的免疫原快速激活系統(tǒng)血液固有免疫炎癥反應(yīng)的體外實驗免疫研究——自然與分離體系也是獨一無二的。我們的實驗研究體系是系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)最簡單、最客觀的系統(tǒng)免疫學(xué)研究方法，是獨創(chuàng)的具有中國特色和生命力的方法，是系統(tǒng)免疫學(xué)研究戰(zhàn)略學(xué)方面的突破。將系統(tǒng)免疫學(xué)研究范圍從白細胞系統(tǒng)擴展到所有血循環(huán)系統(tǒng)中血細胞之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究，這是一大創(chuàng)舉[14-15]，必將會逐步被學(xué)術(shù)界所認識，并進一步推廣及深化。

總而言之，免疫原快速激活血細胞固有免疫活性體外研究方法從發(fā)展時間上可劃分為：①分離法的紅細胞酵母菌花環(huán)（包括紅細胞 C3b 受體花環(huán)、紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)等）；②分離法的腫瘤紅細胞花環(huán)、腫瘤淋巴細胞花環(huán)、腫瘤粒細胞花環(huán)；③自然法的全血細胞花環(huán)；④系統(tǒng)免疫學(xué)自然與分離體系。最近形成的現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)自然與分離體系方法，根據(jù)研究目的的不同可選擇不同的設(shè)計和計算公式，這些方法學(xué)的具體設(shè)計還有很大的研究空間，值得我們深入探討[15]。本文回顧了系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)研究思路與方法創(chuàng)新及演變的歷程，希望對讀者了解系統(tǒng)血液免疫學(xué)的形成與創(chuàng)建能有所幫助。

[1]Guo F, Qian BH, Zhang LZ.Modern red blood celll immunology.Shanghai: Second Military Medical University Press, 2002:1-292.(in Chinese)郭峰, 錢寶華, 張樂之.現(xiàn)代紅細胞免疫學(xué).上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2002:1-292.

[2]Guo F, Yu ZQ, Zhao ZP, et al.Preliminary study on the immune function of human red cells.Natl Med J China, 1982, 62(12):715-716.(in Chinese)郭峰, 虞紫茜, 趙中平, 等.紅細胞免疫功能的初步研究.中華醫(yī)學(xué)雜志, 1982, 62(12):715-716.

[3]Guo F.Thoughts of Golden pen award for first place.Natl Med J China, 2005, 85(47):3382-3383.(in Chinese)郭峰.金筆獎榜首有感.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 85(47):3382-3383.

[4]Stoiber H, Pruenster M, Ammann CG, et al.Complement-opsonized HIV: the free rider on its way to infection.Mol Immunol, 2005, 42(2):153-160.

[5]Guo F, Zhang JJ, Cui Y, et al.Relationships between CR1 genomic density polymorphism on red cell and blood corpuscle innate immune activity in patients with ovarian carcinoma.Chin J Microbiol Immunol,2003, 23(8):595-597.(in Chinese)郭峰, 張俊潔, 崔英, 等.卵巢癌患者紅細胞CR1密度相關(guān)基因組多態(tài)性與血細胞天然免疫活性相關(guān)性研究.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2003, 23(8):595-597.

[6]Guo F, Lu PE, Wang HB, et al.The founding of experiment about fresh blood quick native immune reaction to cancer cells.Shenzhen J Integrated Traditional Chin West Med, 1999, 9(5):7-10.(in Chinese)郭峰, 盧培恩, 王海濱, 等.新鮮血對癌細胞快速自然免疫反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)與實驗方法的創(chuàng)建.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 1999, 9(5):7-10.

[7]Guo F, Wang HB, Yun Y, et al.Premonitory value of blood corpuscleinnate immune reaction activity in cancer patients.Chin J Clin Rehabil, 2004, 8(26):5712-5713.

[8]Guo F.To establish an up-to-dete experimental study system for modern systemic immunology.Med J Chin PLA, 2006, 3(2):89-91.(in Chinese)郭峰.構(gòu)建現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)新的實驗研究體系.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2006, 31(2):89-91.

[9]Guo F, Zhang LZ Hua MX, et al.Experimental system of hemaimmune reaction road map.Shenzhen J Integrated Traditional Chin West Med, 2005, 15(1):4-7.(in Chinese)郭峰, 張樂之, 花美仙, 等.血液免疫反應(yīng)路線圖實驗體系初步研究.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2005, 15(1):4-7.

[10]Guo F.The theory of red cell innate immune reaction main road and modern systems immunology.Chin J Nat, 2006, 28(2):79-83.(in Chinese)郭峰.紅細胞天然免疫主干道理論與現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué).自然雜志,2006, 28(2):79-83.

[11]Guo F.Systemic hematogenic quick innate immunoreaction.Int J Immunol, 2008, 31(5):394-397.(in Chinese)郭峰.系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng).國際免疫學(xué)雜志, 2008, 31(5):394-397.

[12]Guo F, Hua MX, Zhang LZ, et al.Truthful experimental study of systemic hematogenic immunoreactions activated by antigens.Chin J Immunol, 2007, 23(8):732-737, 742.(in Chinese)郭峰, 花美仙, 張樂之, 等.抗原激活系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)實驗研究.中國免疫學(xué)雜志, 2007, 23(8):732-737, 742.

[13]Dai RW.From engineering cybernetics to cyberspace for workshop of metasynthetic engineering.Chin J Nat, 2005, 27(6):366-370.(in Chinese)戴汝為.從工程控制論到綜合集成研討廳體系-紀念錢學(xué)森先生歸國50周年.自然雜志, 2005, 27(6):366-370.

[14]Wang DB.Immunohematology.Beijing: Peking University Medical Press, 2009:85-99.(in Chinese)王德炳.血液免疫學(xué).北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2009:85-99.

[15]Guo F.A new recognition: systems blood rapid innate immune response//Schmidt RD: Proceedings of 2nd European congress of Immunology, Berlin, Germany, 2009.Bologna Italy: Medimond International Proceeding Division, 2009:369-372.