治療性人源抗狂犬病毒抗體研究進展

陳哲，孫麗娜，梁米芳

治療性人源抗狂犬病毒抗體研究進展

陳哲，孫麗娜，梁米芳

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus，RV）引起的人獸共患疾病，發(fā)病后死亡率幾乎達百分之百?？袢《緦購棤畈《究疲≧habdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus），基因組編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白，其中由 G 基因編碼的糖蛋白，是病毒與宿主細胞結(jié)合的配體，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，與病毒的毒力、致病性密切相關(guān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的狂犬病暴露后預(yù)防措施，對狂犬病三級暴露后的預(yù)防主要是采用狂犬疫苗注射結(jié)合抗狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG）的方法。目前使用的兩類 RIG 為人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG）和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin，ERIG）。但 ERIG 副反應(yīng)比較嚴(yán)重，而且對某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制；HRIG 價格昂貴，供應(yīng)量有限并且有潛在的病原威脅。而抗狂犬病毒單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）具有中和效果高、安全性好、成本低、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點，能夠取代 RIG 用于狂犬病的暴露后預(yù)防[1]。

1 狂犬病毒分子遺傳特征

狂犬病毒基因組為不分節(jié)段的單股負鏈 RNA，全長約12 kb?；蚪M的 3’ 端至 5’ 端依次排列著 N、P、M、G 和L 共 5 個結(jié)構(gòu)基因，各基因的序列長度分別為 1421、991、805、1675 和 6429 個核苷酸，分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白（L）。每個基因均由 3’ 端非編碼區(qū)、編碼區(qū)和 5’ 端非編碼區(qū)三部分組成。其中編碼核蛋白的 N 基因是狂犬病毒屬的主要基因分型依據(jù)。

根據(jù)不同毒株的免疫血清反應(yīng)和抗狂犬病毒單克隆抗體的分析，可將狂犬病毒分成四個血清型：血清 I 型（狂犬病毒）、血清 II 型（Lagos 病毒）、血清 III 型（Mokola 病毒）、血清 IV 型（Duvenhage 病毒）。1993 年 Bourhy 等[2]根據(jù)核蛋白基因的 N 末端 500 個核苷酸的相似百分率，將狂犬病毒屬分為 6 個基因型：其中基因 1 型到基因 4型與血清型分型相同，其余分型為基因 5 型（EBL1 病毒）、基因 6 型（EBL2 病毒）。1996 年 7 月，澳大利亞的 Gould等[3]發(fā)現(xiàn)果蝠體內(nèi)的澳大利亞蝙蝠狂犬相關(guān)病毒（Australia bat virus，ABLV），被定為基因 7 型。2001 年，Knipe 等[4]對狂犬病毒基因分型進行比較研究認(rèn)為 7 個基因型又可分為 2 個進化組：第一組包括基因型 1、4、5、6 和 7，第二組包括基因型 2 和 3。同組內(nèi)一種病毒的抗體與其他病毒可產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不同組的病毒之間不能產(chǎn)生交叉免疫保護。2008 年，Delmas 等[5]利用狂犬病毒全基因組序列對7 個基因型包括 24 株狂犬相關(guān)病毒進行基因分析，分析結(jié)果肯定了 7 個基因型又可分為 2 個進化組的結(jié)論。我國尚未系統(tǒng)地對狂犬相關(guān)病毒進行研究，目前僅發(fā)現(xiàn)了基因 1型病毒。

2 狂犬病毒糖蛋白表位研究

狂犬病毒糖蛋白基因共編碼 524 個氨基酸，前 19 個氨基酸構(gòu)成疏水性的信號肽，糖蛋白前體切除 N 端的 19 個氨基酸殘基后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)糖基化等修飾成為成熟的糖蛋白。成熟的狂犬病毒糖蛋白是由 505 個氨基酸組成的多肽。糖蛋白以三聚體的形式位于狂犬病毒脂蛋白包膜上，長 8 ~ 10 nm，相對分子量約 65 ~ 70 kD。成熟的狂犬病毒糖蛋白分成三個區(qū)域：膜外區(qū) 1 ~ 439 位氨基酸，位于病毒顆粒包膜的表面，參與識別受體與膜融合反應(yīng)，并攜帶有 B 細胞和T 細胞的抗原位點；跨膜區(qū) 440 ~ 461 位氨基酸，由 22 個氨基酸組成連續(xù)性疏水區(qū)，與糖蛋白在病毒雙層脂膜上的固定有關(guān)；膜內(nèi)區(qū) 462 ~ 505 位氨基酸，定位于病毒包膜的內(nèi)表面，提供基質(zhì)蛋白和核蛋白作用的位點。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)在不同地方狂犬病毒株中差異較大，氨基酸同源性在 50% ~ 60% 之間，膜外區(qū)的保守性略高一些，氨基酸同源性高于 90%[6]。

用對單克隆抗體逃逸株的點突變分析和單克隆抗體的中和試驗研究糖蛋白上抗原的結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)糖蛋白上至少存在 3 個主要中和抗體結(jié)合位點：抗原位點 I、抗原位點II 和抗原位點 III。其中抗原位點 II 和抗原位點 III 是病毒與中和抗體結(jié)合的主要部位?？乖稽c II 比較保守，由第 34 ~ 42 位和第 198 ~ 200 位氨基酸殘基兩個表位通過二硫鍵連接形成，是一個典型的空間構(gòu)型抗原位點[7]。其中34 ~ 42、147、184、198 ~ 200 位氨基酸至關(guān)重要[8]?？乖稽c III 位于 330 ~ 357 位，其中 333 ~ 338 位氨基酸區(qū)段是中和抗體主要結(jié)合部位，雖然是一段連續(xù)的氨基酸區(qū)段，但也是一個空間構(gòu)型抗原位點，其中第 333、336 及 338 位氨基酸是最關(guān)鍵的氨基酸[9]。而位于 342 ~ 343 位氨基酸殘基則是次要的中和位點[7]?？乖稽c III 的 333 位精氨酸與狂犬病毒毒力的丟失有著緊密關(guān)系。根據(jù)最近報道，抗原位點 I 位于 218 ~ 240 位氨基酸區(qū)域，是一個線性中和抗原表位，其最小結(jié)合區(qū)為 226 ~ 231 位的 KLCGVL，核心殘基為 K-CGV-[10]。通過對抗狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體逃逸株的序列分析證明，只要 1 個氨基酸被替代，病毒便可逃避特異性單克隆抗體的中和[8]。

狂犬病毒糖蛋白是狂犬病毒的主要病毒抗原，它不僅介導(dǎo)病毒與細胞的結(jié)合，決定病毒的毒力，還是狂犬病毒所有蛋白中唯一能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白。因此，研究針對狂犬病毒糖蛋白的單克隆抗體，不僅能促進狂犬病毒的機制研究，還能應(yīng)用于狂犬病毒的臨床治療。

3 狂犬病毒單克隆抗體研究

1975 年 B 淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)問世，1978 年，Wiktor 和 Koprowski[11]通過 B 淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)獲得了抗狂犬病毒單克隆抗體，并證明能夠保護動物抵抗致死性的狂犬病毒的攻擊。1990 年，Dietzschold 等[12]獲得了 9 種能夠識別狂犬病毒糖蛋白、核蛋白和基質(zhì)蛋白特異性抗原決定簇的單克隆抗體，但其中只有針對狂犬病毒糖蛋白的單克隆抗體 Mab57 能夠中和多種狂犬病毒。2003 年，Prosniak 等[13]將 Mab57 通過基因重組并在彈狀病毒載體中表達，命名 SO57。同年，Jones等[14]通過 PER.C6 系統(tǒng)對 SO57 進行改造，改名為 CR57。2007 年，Muhamuda 等[15]獲得了多株鼠源單克隆抗體，并在動物保護實驗中證明可以在一定程度上保護狂犬病毒的致死性攻擊。

早期的雜交瘤單克隆抗體一般為鼠源單克隆抗體，鼠源單克隆抗體在人體中常不能有效地活化補體和 Fc 受體相關(guān)的效應(yīng)，而且由于鼠源單克隆抗體是異源蛋白，在體內(nèi)很快就被清除掉，并且容易產(chǎn)生人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA），從而削弱其治療的有效性，這些推動了人源單克隆抗體的產(chǎn)生[16]。而噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)，大量獲得人源基因工程抗體成為可能。2001 年，Ray 等[17]利用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建了人源抗狂犬病毒單鏈?zhǔn)删w抗體庫。篩選獲得了人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體。并有可能取代目前使用的人免疫球蛋白用于暴露后治療。2005年，Kramer 等[18]構(gòu)建了人源抗狂犬病毒單鏈?zhǔn)删w抗體庫，并將獲得的 147 種單鏈抗體中的 21 株改造成為全長人 IgG，其中一株單克隆抗體 CR4098 針對狂犬病毒糖蛋白 III 號位點并具有較高的親和力。2007 年，Sloan 等[19]利用攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得了人源抗狂犬病毒單克隆抗體 17C7，17C7 針對狂犬病毒糖蛋白 III號位點并能保護倉鼠被動免疫后完全抵抗致死劑量狂犬病毒的攻擊。2009 年，Houimel 和 Dellagi[20]構(gòu)建了人源抗狂犬病毒 Fab 噬菌體抗體庫，并篩選獲得了 6 株 Fab 抗體，其中 3 株特異性針對狂犬病毒糖蛋白 III 號位點并顯示了一定的中和狂犬病毒 CVS-11 株的能力。目前，我國在人源抗狂犬病毒單克隆抗體上也取得了一定的進展，趙小玲等[21]通過核糖體展示技術(shù)構(gòu)建了人源抗狂犬病毒單鏈核糖體抗體庫，并獲得了幾株針對狂犬病毒并能特異性識別狂犬糖蛋白的單鏈抗體。由于狂犬病毒基因型別較多，糖蛋白的序列并不十分保守，使用針對單一中和抗原位點的單克隆抗體不能起到廣譜、安全的療效。如何將針對不同中和抗原位點的單克隆抗體聯(lián)合起來使用，成為了治療性狂犬病毒單克隆抗體面對的重任。

1989 年，Schumacher 等[22]制備了多株針對狂犬病毒糖蛋白、核蛋白的鼠源單克隆抗體，并將這些針對不同狂犬病毒蛋白的鼠源單克隆抗體混合使用稱之為單克隆抗體雞尾酒（cocktail of anti-rabies monoclonal antibodies，McAb-C），對動物的保護性實驗表明：該方法不僅具有被動免疫后完全抵抗致死劑量狂犬病毒攻擊的能力，還具有暴露后保護作用。2003 年，Prosniak 等[13]通過基因重組將 3 株針對不同抗原表位的中和性單克隆抗體在彈狀病毒載體上表達，并將改造后的單克隆抗體混合在一起使用，并在小鼠攻毒試驗中證明與 HRIG 的保護效果近似，在成本和安全性等方面優(yōu)于 HRIG，可用于狂犬病的暴露后預(yù)防。2005 年，Goudsmit等[23]將針對狂犬病毒糖蛋白 I 號位點的中和抗體 CR57和針對狂犬病毒糖蛋白 III 號位點的中和抗體 CR4098 混合使用，中和了 26 種典型的街毒株。對動物的保護性實驗表明，利用單克隆抗體雞尾酒療法進行治療具有可行性和優(yōu)越性。2008 年，由 Crucell 公司開發(fā)的 CR57 和 CR4098構(gòu)成的單克隆抗體雞尾酒 CL184 在美國和印度完成了I 期臨床，該臨床結(jié)果表明 CL184 安全有效，可取代 RIG，用于暴露后預(yù)防[24]。出于低成本的考慮，2009 年 Müller等[25]開發(fā)了一種由 5 種鼠源單克隆抗體（E559.9.14、1112-1、62-71-3、M727-5-1 和 M777-16-3）組成的雞尾酒，希望能取代 HRIG 進行狂犬病毒暴露后預(yù)防并在發(fā)展中國家得到廣泛使用。

4 結(jié)語

從血清多克隆抗體到雜交瘤單克隆抗體，從鼠源單克隆抗體到 1984 年的人-鼠嵌合抗體，標(biāo)志著基因工程抗體誕生，隨后新型基因工程抗體不斷出現(xiàn)，如人源化抗體、單價小分子抗體、多價小分子抗體等。但早期的基因工程抗體均有其各自的缺點，如基因取自雜交瘤細胞，生產(chǎn)抗體的流程復(fù)雜，嵌合抗體和人源化抗體不能完全解決 HAMA 反應(yīng)，難以對抗體進行改造獲得高親和力抗體等。20 世紀(jì) 90 年代初，建立了噬菌體抗體庫技術(shù)，采用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗體不必進行動物免疫，易于制備稀有抗原的抗體、能獲得人源和高親和力抗體。

如今，獲得人源抗體的方法越來越多，如噬菌體展示、核糖體展示、酵母展示或是使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的具有人免疫球蛋白基因的小鼠均能獲得人源抗體。而 PER.C6 等單克隆抗體的高效表達細胞系則為人源單克隆抗體進入臨床治療的大規(guī)模生產(chǎn)獲得低成本抗體提供了保證。目前已經(jīng)有幾十種人源的單克隆抗體進入臨床的治療試驗階段，這些單克隆抗體針對的抗原包括腫瘤、自身免疫疾病和傳染病中的主要抗原，如針對黑色素瘤的 4B5，針對干擾素的 D2E2 和針對乙肝的 Ostovir 等。

隨著對狂犬病毒糖蛋白及其單克隆抗體研究的不斷深入，如何用單克隆抗體取代現(xiàn)有被動免疫制劑的思路越來越清晰。從最早將針對糖蛋白、核蛋白等不同蛋白的單克隆抗體組成單克隆抗體雞尾酒，到目前最新的單克隆抗體雞尾酒CL184 臨床實驗的成功。隨著不斷出現(xiàn)更新更好的人源單克隆抗體，單克隆抗體雞尾酒取代人 RIG（HRIG）和馬 RIG（ERIG）進行狂犬病暴露后預(yù)防只是時間問題。

參考文獻

[1] de Kruif J, Bakker AB, Marissen WE, et al. A human monoclonal antibody cocktail as a novel component of rabies postexposure prophylaxis. Annu Rev Med, 2007, 58:359-368.

[2] Bourhy H, Kissi B, Tordo N. Molecular diversity of the Lyssavirus genus. Virology, 1993, 194(1):70-81.

[3] Gould AR, Hyatt AD, Lunt R, et al. Characterisation of a novel lyssavirus isolated from Pteropid bats in Australia. Virus Res, 1998, 54(2):165-187.

[4] Knipe DM, Howley PM,Griffin DE, et al. Fields virology. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001:1245-1257.

[5] Delmas O, Holmes EC, Talbi C, et al. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. PLoS One, 2008, 3(4):e2057.

[6] Lai CY, Dietzschold B. Amino acid composition and terminal sequence analysis of the rabies virus glycoprotein: identification of the reading frame on the cDNA sequence. Biochem Biophys Res commun, 1981, 103(2):536-542.

[7] Benmansour A, Leblois H, Coulon P, et al. Antigenicity of rabies virus glycoprotein. J Virol, 1991, 65(8):4198-4203.

[8] Prehaud C, Coulon P, LaFay F, et al. Antigenic site II of the rabies virus glycoprotein: structure and role in viral virulence. J Virol, 1988, 62(1):1-7.

[9] Seif I, Coulon P, Rollin PE, et al. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. J Virol, 1985, 53(3): 926-934.

[10] Marissen WE, Kramer RA, Rice A, et al. Novel rabies virus-neutralizing epitope recognized by human monoclonal antibody: fine mapping and escape mutant analysis. J Virol, 2005, 79(8):4672-4678.

[11] Wiktor TJ, Koprowski H. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hybridization: detection of antigenic variants. Proc Natl Acad Sci U S A, 1978, 75(8):3938-3942.

[12] Dietzschold B, Gore M, Casali P, et al. Biological characterization of human monoclonal antibodies to rabies virus. J Virol, 1990, 64(6): 3087-3090.

[13] Prosniak M, Faber M, Hanlon CA, et al. Development of a cocktail of recombinant-expressed human rabies virus-neutralizing monoclonal antibodies for postexposure prophylaxis of rabies. J Infect Dis, 2003, 188(1):53-56.

[14] Jones D, Kroos N, Anema R, et al. High-level expression of recombinant IgG in the human cell line per.c6. Biotechnol Prog, 2003, 19(1):163-168.

[15] Muhamuda K, Madhusudana SN, Ravi V. Use of neutralizing murine monoclonal antibodies to rabies glycoprotein in passive immunotherapy against rabies. Hum Vaccin, 2007, 3(5):192-195.

[16] Weiner LM. An overview of monoclonal antibody therapy of cancer. Semin Oncol, 1999, 26(4 Suppl 12):41-50.

[17] Ray K, Embleton MJ, Jailkhani BL, et al. Selection of single chain variable fragments (scFv) against the glycoprotein antigen of the rabies virus from a human synthetic scFv phage display library and their fusion with the Fc region of human IgG1. Clin Exp Immunol, 2001, 125(1):94-101.

[18] Kramer RA, Marissen WE, Goudsmit J, et al. The human antibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected from immune libraries. Eur J Immunol, 2005, 35(7):2131-2145.

[19] Sloan SE, Hanlon C, Weldon W, et al. Identification and characterization of a human monoclonal antibody that potently neutralizes a broad panel of rabies virus isolates. Vaccine, 2007, 25(15):2800-2810.

[20] Houimel M, Dellagi K. Isolation and characterization of human neutralizing antibodies to rabies virus derived from a recombinant immune antibody library. J Virol Methods, 2009, 161(2):205-215.

[21] Zhao XL, Chen WQ, Yang ZH, et al. Selection and affinity maturation of human antibodies against rabies virus from a scFv gene library using ribosome display. J Biotechnol, 2009, 144(4):253-258.

[22] Schumacher CL, Dietzschold B, Ertl HC, et al. Use of mouse anti-rabies monoclonal antibodies in postexposure treatment of rabies. J Clin Invest, 1989, 84(3):971-975.

[23] Goudsmit J, Marissen WE, Weldon WC, et al. Comparison of an anti-rabies human monoclonal antibody combination with human polyclonal anti-rabies immune globulin. J Infect Dis, 2006, 193(6): 796-801.

[24] Bakker AB, Python C, Kissling CJ, et al. First administration to humans of a monoclonal antibody cocktail against rabies virus: safety, tolerability, and neutralizing activity. Vaccine, 2008, 26(47):5922-5927.

[25] Müller T, Dietzschold B, Ertl H, et al. Development of a mouse monoclonal antibody cocktail for post-exposure rabies prophylaxis in humans. PLoS Negl Trop Dis, 2009, 3(11):e542.

基金項目：國家高技術(shù)發(fā)展研究計劃（863 計劃）（2009AA02Z109）

作者單位：100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室

通訊作者：梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

收稿日期：2010-03-03

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.009