RUNX3基因及其與肝癌的相關(guān)性研究

盧燕輝， 李建國(guó)

RUNX3基因?yàn)橐环N新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，廣泛表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞、間葉細(xì)胞、血液細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。其與胃癌、乳癌、大腸癌的相關(guān)性研究較多，本文就RUNX3基因與肝癌的相關(guān)性研究作一綜述。

1 關(guān)于RUNX3基因

1.1 RUNX3基因的定義 人RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human runt-related transcription factor 3，RUNX3)早在1994年被Levanon等發(fā)現(xiàn)，先后被命名為急性髓性白血病2基因、多瘤病毒強(qiáng)化因子結(jié)合蛋白2基因、核心結(jié)合因子α3基因。作為RUNT家族成員，他參與胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控，并且是RUNT家族中最小、迄今研究也最少的基因成員，是哺乳動(dòng)物RUNT家族進(jìn)化的基礎(chǔ)［1］。

1.2 RUNX家族基因產(chǎn)物的功能 在哺乳動(dòng)物中RUNX基因家族由 3個(gè)成員組成，即 RUNX1、RUNX2和RUNX3，各有不同的生物學(xué)功能。30%的人類急性白血病伴RUNX1基因的改變，人類鎖骨、顱骨發(fā)育不良等骨疾病與 RUNX2的突變有關(guān)［2-3］，脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育及胃黏膜上皮細(xì)胞的增生異常與RUNX3的表達(dá)缺失或下降相關(guān)［4-5］。

1.3 RUNX3基因的定位與結(jié)構(gòu)特點(diǎn) RUNX3基因位于人類1號(hào)染色體的1p36和鼠4號(hào)染色體上，人類RUNX3蛋白由415個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是由α和β亞單位構(gòu)成的異二聚體。α亞單位含有128個(gè)氨基酸殘基組成的RUN結(jié)構(gòu)域(RUNT Domain，RD)，RD位于RUNX的氨基末端，介導(dǎo)RUNX蛋白與DNA結(jié)合和與蛋白的相互作用。α亞單位介導(dǎo)RD與靶DNA特殊基因序列的結(jié)合，β亞單位能增強(qiáng)RD與靶DNA的結(jié)合力［6-7］。RUNX3基因全長(zhǎng)約67kb，含有P1和P2兩個(gè)啟動(dòng)子，6個(gè)外顯子和1 290 bp的開(kāi)放閱讀框，內(nèi)含子1跨越了整條基因全長(zhǎng)的一半(35 Kb)。RUNX3基因含有2個(gè)大的高度保守的CpG島，一個(gè)位于外顯子2附近，另一個(gè)位于外顯子6起始部分。兩個(gè)啟動(dòng)子富含GC，都沒(méi)有TATA盒而有CCAAT盒，兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域含數(shù)個(gè)分離的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，RUNX3 mRNA主要來(lái)自于P2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，P2啟動(dòng)子GC含量(64%)高于P1啟動(dòng)子［1］。

1.4 RUNX3在免疫系統(tǒng)發(fā)育中的作用 Woolf等［8］發(fā)現(xiàn)RUNX3高表達(dá)于胸腺髓質(zhì)。RUNX3基因敲除小鼠胸腺細(xì)胞譜系后CD4表達(dá)異常，CD8+T細(xì)胞成熟障礙;小鼠外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD4，增殖能力下降;小鼠的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和同種異體免疫的腹腔灌洗T細(xì)胞的數(shù)量都顯著下降。由此認(rèn)為 RUNX3與 RUNX1一起參與了小鼠胸腺CD8+T淋巴細(xì)胞的分化，都是CD4基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子。研究顯示RUNX3在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factorbeta，TGF-β)誘導(dǎo)的 B 細(xì)胞IgA亞型的轉(zhuǎn)換中起重要作用。TGFβ可以誘導(dǎo)小鼠脾臟B細(xì)胞和IgM+B細(xì)胞胚系Igα基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致B細(xì)胞IgA亞類的轉(zhuǎn)換。

1.5 RUNX3與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RUNX3－/－的小鼠胃黏膜細(xì)胞增殖速度加快，對(duì)TGF-β的抑制生長(zhǎng)沒(méi)有反應(yīng)，相對(duì)觀察的正常小鼠的胃黏膜細(xì)胞的增殖能顯著的被TGF-β抑制［9］，說(shuō)明RUNX3是通過(guò) TGF-β 通路來(lái)調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡的。Li等［10］最近研究RUNX3的腫瘤抑制作用發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)裸鼠的致癌作用與RUNX3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于p53/-小鼠腺胃的RUNX3－/－正常上皮細(xì)胞可在裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤，而RUNX3+/+上皮細(xì)胞則不能。為了檢測(cè)RUNX3對(duì)胃黏膜細(xì)胞分化的調(diào)控，分別取 RUNX3－/－p53－/－和 RUNX3+/+p53－/－小鼠胃黏膜細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)RUNX3+/+p53－/－的胃黏膜有含有腺體結(jié)構(gòu)的柱狀細(xì)胞，細(xì)胞排列極性好，和正常的胃黏膜細(xì)胞相似，而相對(duì)的RUNX3－/－p53－/－細(xì)胞之間缺少連接，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腺體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列沒(méi)有極性，這些現(xiàn)象說(shuō)明RUNX3缺失時(shí)胃黏膜細(xì)胞即處于低分化狀態(tài)，證明RUNX3具有調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的正常分化的功能。這些都說(shuō)明RUNX3是通過(guò)使TGF-β介導(dǎo)凋亡通路中的一些凋亡因子激活來(lái)介導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞正常凋亡活動(dòng)的，當(dāng)RUNX3失活后，正常凋亡受到抑制，胃黏膜細(xì)胞的增殖和凋亡間動(dòng)態(tài)平衡被打亂，遺傳學(xué)上不穩(wěn)定的細(xì)胞便可克隆擴(kuò)增而發(fā)生胃癌。

1.6 RUNX3抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力 TIMP-1是MMP9主要的內(nèi)源抑制因子，進(jìn)一步RTPCR、Western blot及ELISA的結(jié)果證實(shí)，RUNX3能上調(diào)TIMP-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)以及胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中TIMP-1的水平，因此RUNX3可通過(guò)上調(diào)TIMP-1的表達(dá)水平，從而抑制MMP9的酶活性;ELISA還發(fā)現(xiàn)RUNX3可以抑制胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達(dá)水平，提示 RUNX3通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)來(lái)減少胃癌的血管生成。經(jīng)過(guò)Trizol法抽提SGC7901/pBK-RUNX3和空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞SGC7901/pBK-CMV的總RNA，再通過(guò)瓊脂糖電泳檢查及紫外定量分析表明所提取得RNA無(wú)明顯降解，其質(zhì)和量均符合芯片檢測(cè)要求。經(jīng)熒光探針的制備、純化及定量，芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等步驟得到差異表達(dá)的基因。以兩種細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度的比值小于0.5或者大于2作為判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，RUNX3表達(dá)上調(diào)后，SGC7901/pBK-RUNX3細(xì)胞中有14個(gè)基因表達(dá)被上調(diào)，109個(gè)基因表達(dá)被下調(diào)［11］。在基因芯片篩選出的下游基因中，通過(guò)RT-PCR對(duì)個(gè)別差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)接頭分子CRKⅡ的表達(dá)在胃癌細(xì)胞 MKN28和 SGC7901中可被 RUNX3抑制。RUNX3作為轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)TIMP-1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，pBKRUNX3質(zhì)粒與pGL-TIMP-1共轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的激發(fā)熒光強(qiáng)度顯著高于質(zhì)粒與pBK-CMV空載體轉(zhuǎn)染的MKN28細(xì)胞，表明RUNX3可以增強(qiáng)TIMP-1。啟動(dòng)子的活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含TIMP-1啟動(dòng)子上2個(gè)RUNX3結(jié)合位點(diǎn)的序列的特異性引物，經(jīng)RUNX3抗體沉淀后的DNA模版可以擴(kuò)增出特異性的片段，提示無(wú)論是內(nèi)源性表達(dá)的RUNX3還是外源性的 RUNX3均可在細(xì)胞內(nèi)與TIMP-1的啟動(dòng)子結(jié)合并相互作用。進(jìn)一步EMSA和Supper Shift試驗(yàn)結(jié)果顯示:SGC7901細(xì)胞核蛋白提取物可以使TIMP-1啟動(dòng)子的雙鏈DNA探針的電泳條帶滯后，而RUNX3抗體可以使電泳條帶進(jìn)一步滯后。表明RUNX3可以與TIMP-1啟動(dòng)子上的兩個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合［12］。

1.7 RUNX3的抑癌機(jī)制 RUNX3基因是 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，TGF-β是許多細(xì)胞生長(zhǎng)的有效抑制因子，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生［11］。TGF-β信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由Smad蛋白介導(dǎo)，而RUNX基因的每種形式均可與R-Smad(Smad2、Smad3)結(jié)合而對(duì)TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生重要影響。Zaidi等［13］的研究表明，在 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，被激活的Smad復(fù)合物需要在RUNX基因(包括RUNX3)的指導(dǎo)下，才能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)特定靶位點(diǎn)，與RUNX基因共同激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)細(xì)胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用。早前Li等［10］也發(fā)現(xiàn)，剔除RUNX3基因的小鼠表現(xiàn)為胃黏膜異常增生，并對(duì)TGF-β所誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡作用缺乏反應(yīng)。這些研究均提示RUNX3基因可能作為TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，參與TGF-β對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控作用。

2 RUNX3基因表達(dá)降低或缺失的機(jī)制

2.1 RUNX3突變與表達(dá) 突變是腫瘤抑制基因失活的主要機(jī)制之一。Li等［10］采用PCR-SSCP方法檢測(cè)119例胃癌組織中RUNX3表達(dá)下調(diào)是否與RUNX3基因編碼區(qū)域突變有關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1例(1/119)胃癌組織存在RUNX3突變，其突變位點(diǎn)位于RUNX保守區(qū)C373 C-T的轉(zhuǎn)換，使第122位點(diǎn)精氨酸轉(zhuǎn)變成半胱氨酸(R122C)。然而，實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)配對(duì)的正常胃黏膜組織，因此尚不能確定該結(jié)果是否屬于真正的突變。為了進(jìn)一步證實(shí)R122C突變的意義，Guo等［14］分別將野生型和突變型RUNX3基因(R122C)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株MKN74(RUNX3－/－)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUNX3野生型組可以明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而突變與空載體組生長(zhǎng)曲線相似，提示突變型RUNX3(Rl22C)的活性降低/失活，不能抑制 MKN74細(xì)胞的生長(zhǎng)。Wei等［15］近來(lái)對(duì)6株胃癌細(xì)胞系RUNX3基因編碼區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變發(fā)生，認(rèn)為突變不是RUNX3基因表達(dá)降低或缺失的主要機(jī)制。可見(jiàn)，RUNX3基因突變與胃癌的關(guān)系尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

2.2 RUNX3甲基化與表達(dá) DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一個(gè)重要方式，DNA的甲基化狀態(tài)受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的調(diào)節(jié)，該酶能使CpG島的胞嘧啶環(huán)5'位的氫被s-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，變成5'-甲基胞嘧啶［16］。DNA甲基化主要發(fā)生在富含CpG島的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)該區(qū)域的甲基化將直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子如AP-2、c-Myc/Myn、CREB、E2F 等與啟動(dòng)子結(jié)合，從而使基因不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平降低啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化是腫瘤抑制基因失活的另一主要機(jī)制RUNX3啟動(dòng)子P2區(qū)域有一個(gè)典型CPG島。近年來(lái)，有關(guān)人類各種腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中RUNX3表達(dá)下調(diào)的研究也漸有報(bào)道，而RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致RUNX3表達(dá)下調(diào)的主要原因之一，其中包括肺癌(7/16，43.8%)、膀胱癌(90/124，73%)、肝癌(30/73，41.1%)和結(jié)腸癌(19/91，21%)等［17-18］。Li等［10］用甲基化敏感酶和不敏感酶從15個(gè)胃癌細(xì)胞系中消化分離出基因組DNA，檢測(cè)RUNX3啟動(dòng)子P2區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示RUNX3低表達(dá)或失表達(dá)與RUNX3啟動(dòng)子附近區(qū)域甲基化有關(guān)。研究者采用甲基化特異性PCR方法(MR)檢測(cè)了6株具有代表性的胃癌細(xì)胞系(其中3株表達(dá) RUNX3，3株無(wú) RUNX3表達(dá))及3例胃癌組織和配對(duì)的正常胃黏膜組織中的DNA甲基化狀態(tài)，結(jié)果3株RUNX3失表達(dá)的細(xì)胞系(SNU1，MKN28，MKN74)中RUNX3外顯子1區(qū)的CpG二核苷酸序列的C殘基完全甲基化，而表達(dá)RUNX3的3株細(xì)胞系(MKN1，RF1，RF48)則在該區(qū)域不存在甲基化;同樣3例胃癌組織中RUNX3全部失表達(dá)，他們的RUNX3外顯子1區(qū)的CpG二核苷酸序列的C殘基也完全甲基化，而3例正常胃黏膜組織均表達(dá)RUNX3，在相應(yīng)區(qū)域未檢測(cè)到甲基化。Waki等［19］檢測(cè)了10株胃癌細(xì)胞系、93例胃癌組織及相應(yīng)正常胃黏膜組織RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果7株(7/10，70%)胃癌細(xì)胞系、42例(42/93，45%)胃癌組織和7例(7/93，8%)正常胃黏膜組織存在甲基化。Kim等［20］對(duì)75例胃癌、48例肝癌、37例喉癌、24例肺癌、25例乳腺癌、44例前列腺癌、24例子宮內(nèi)膜癌、61例結(jié)腸癌、40例宮頸癌和各種胃癌前期病變組織(胃腺瘤77例、慢性胃炎伴腸上皮化生32例和慢性胃炎不伴腸上皮化生99例)RUNX3甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)前腸器官來(lái)源的腫瘤組織存在RUNX3甲基化，在胃癌組織中RUNX3甲基化發(fā)生率為64%，而在各種胃癌前期病變組織中也存在不同程度的RUNX3甲基化，其中胃腺瘤27.3%，慢性胃炎伴腸上皮化生28.1% 和慢性胃炎不伴腸上皮化生8.1%。因此認(rèn)為RUNX3甲基化發(fā)生隨癌前期病變向癌的方向發(fā)展而增加，RUNX3甲基化檢測(cè)有望成為多種癌診斷的生物標(biāo)記物。近來(lái)，Homma等［21］對(duì)RUNX3基因甲基化異常機(jī)制與胃癌的關(guān)系做了更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胃癌細(xì)胞系(9/10，90%)、胃癌組織(43/45，96%)和配對(duì)的正常胃黏膜組織(43/45，96%)均存在RUNX3基因5'端CpG島的甲基化，而在被視為導(dǎo)致基因沉默的關(guān)鍵部位——轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近區(qū)域的甲基化發(fā)生率較低，分別為40%(4/10)、53%(24/45)和 11%(5/45)，因此認(rèn)為，RUNX3基因高甲基化起初發(fā)生在5＇端CpG島，進(jìn)而向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)區(qū)域擴(kuò)展，最終導(dǎo)致RUNX3 mRNA失表達(dá)，RUNX3基因CpG島多區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

3 國(guó)內(nèi)外RUNX3基因在肝癌方面的研究現(xiàn)狀

Mori等［22］分析了5種肝癌細(xì)胞系和41例肝細(xì)胞癌組織中RUNX3的遺傳學(xué)以及表遺傳學(xué)信息，結(jié)果在80.0%(4/5)的癌細(xì)胞系和75.6%(31/41)的肝癌患者中檢測(cè)到RUNX3啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，在 37.8%的患者中檢測(cè)到 RUNX3的 LOH。Park等［23］專門研究了肝癌中RUNX3的甲基化狀態(tài)及其與重要臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)40.0%(4/10)的癌細(xì)胞系和41.1%(30/73)的肝癌患者中都存在RUNX3的甲基化，并與組織學(xué)分級(jí)、微血管浸潤(rùn)和臨床分期密切相關(guān)，甚至認(rèn)為RUNX3的甲基化是發(fā)生在肝癌形成早期的重要事件。Xiao等［24］對(duì)肝細(xì)胞癌RUNX3基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用進(jìn)行初步研究，他們用3個(gè)SNP作為RUNX3基因的標(biāo)志，檢測(cè)RUNX3基因的等位缺失，發(fā)現(xiàn)30.6%(11/36)的信息個(gè)體存在等位缺失，54.4%(49/90)的肝細(xì)胞癌為高甲基化狀態(tài)，而對(duì)應(yīng)的正常肝組織未發(fā)現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)11例存在等位缺失的肝細(xì)胞癌同時(shí)有9例存在高甲基化狀態(tài)，即在肝細(xì)胞癌組中有81.5%的病例RUNX3基因同時(shí)高甲基化和等位缺失而完全失活。其結(jié)果與先前報(bào)道的肝細(xì)胞癌在IP36位點(diǎn)存在30.0%左右的等位缺失結(jié)果基本一致。實(shí)驗(yàn)表明高甲基化和等位缺失共同促進(jìn)了肝細(xì)胞癌RUNX3基因的失活，此結(jié)果還提示肝細(xì)胞癌TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)障礙可能與RUNX3基因失活有關(guān)。隨著甲基化研究技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的基因甲基化狀態(tài)與肝癌的發(fā)生有關(guān)，多數(shù)研究是通過(guò)比較肝癌與癌旁及正常組織之間基因甲基化狀態(tài)差異，來(lái)確定目的基因與HCC發(fā)生的相關(guān)程度。肖文華等［25］發(fā)現(xiàn)，30.6%(11/36)的肝癌患者存在RUNX3的 LOH，54.4%(49/90)的患者存在RUNX3的高甲基化，且11例存在LOH的肝癌中有9例存在高甲基化，而在所有患者中均未發(fā)現(xiàn) RUNX3突變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RUNX3的LOH與門靜脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和微血管受侵有關(guān)。在RUNX3基因與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究中目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)從蛋白水平進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。

4 RUNX3基因的測(cè)定方法

目前，可從DNA、RNA、蛋白三個(gè)水平對(duì)RUNX3基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)及分析。DNA的檢測(cè)多檢測(cè)其DNA的甲基化率，在這方面目前采用最多也最值得肯定的是甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)即MSP-PCR，之前必須先對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行DNA的抽提，然后進(jìn)行凝膠電泳并在凝膠成像分析系統(tǒng)中通過(guò)條帶的顯示進(jìn)行DNA甲基化率的分析;RNA的檢測(cè)多采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)即 RT-PCR，與MSP-PCR相同的是必須進(jìn)行RNA的抽提，不同的是RNA的抽提容易被很多因素干擾而失敗，比如實(shí)驗(yàn)環(huán)境與操作過(guò)程的不合格。目前Trizol抽提法應(yīng)用較為普遍，優(yōu)點(diǎn)是抽提的RNA量較多，缺點(diǎn)是受人為因素的干擾較大，而試劑盒抽提法剛好相反(RNA量較少，受人為因素的干擾較小)，抽提的RNA既可以凝膠電泳并在凝膠成像分析系統(tǒng)中通過(guò)條帶的顯示進(jìn)行RNA分析也可以用分光光度計(jì)進(jìn)行RNA的精確定量，然后用濃度和純度符合要求的RNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)檢測(cè)分析RNA的表達(dá)情況;近年來(lái)引進(jìn)了一項(xiàng)很先進(jìn)的PCR技術(shù)即實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與RT-PCR方法相比，主要有以下特點(diǎn):(1)實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的Ct值，正處于PCR循環(huán)的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期)，即線性期的起始階段，最接近真實(shí)模板量，此時(shí)微小誤差尚小，保證Ct值的重現(xiàn)性［26］，而半定量PCR只能檢測(cè)到肉眼觀察的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，此時(shí)有平臺(tái)效應(yīng)而造成誤差，且屬終點(diǎn)檢測(cè)，未能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察變化趨勢(shì);(2)熒光定量PCR應(yīng)用特異性引物和特異性探針，盡可能避免了常規(guī)PCR的非特異性擴(kuò)增;(3)整個(gè)過(guò)程處于密閉狀態(tài)，減少了樣品后期處理造成的潛在實(shí)驗(yàn)室污染可能;(4)熒光定量PCR以目的基因PCR產(chǎn)物構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠從定量水平上精確計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本中目的基因的起始數(shù)量。以上特點(diǎn)保證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)的可重復(fù)性、準(zhǔn)確性和特異性［27］。蛋白的檢測(cè)可采用免疫組化和Western blot;前者可不用進(jìn)行蛋白的抽提而直接在顯微鏡下通過(guò)細(xì)胞核或核與胞漿的染色來(lái)評(píng)價(jià)陽(yáng)性率進(jìn)而分析蛋白的表達(dá)情況，不足之處是不能對(duì)蛋白進(jìn)行精確定量檢測(cè)且其需要一定的病理學(xué)基礎(chǔ);而后者可以對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行精確定量檢測(cè)，但之前必須進(jìn)行蛋白的抽提。

5 結(jié)語(yǔ)

RUNX3基因作為一種新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，關(guān)于其失活機(jī)制、抑癌機(jī)制及其與腫瘤關(guān)系的研究正在不斷深入。目前研究較多的是RUNX3基因與胃癌的關(guān)系，但其與肝癌關(guān)系的研究還處于萌芽狀態(tài)，這方面的進(jìn)一步研究，勢(shì)必為肝癌的診斷和治療揭開(kāi)新的篇章。

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