基于肽抗原的間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗水通道蛋白4抗體在神經(jīng)精神狼瘡中的臨床意義

曹蕓 陸曉曄 陳曉翔 錢潔 趙江峰 顧越英 葉霜

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科,*風(fēng)濕病科,上海 200001)

抗水通道蛋白4(aquaporin 4,AQ-4)抗體在慢性脫髓鞘病變,如視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)等中已被檢出,在自身免疫病干燥綜合征(Sjogren syndrome,SS)中也被檢出[1-2]。Mehta等[3]報道了1例抗磷脂綜合征合并視神經(jīng)脊髓炎的患者,由于脫髓鞘病變和橫貫性脊髓炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,且SLE患者有大量的自身抗體,故我們推測在神經(jīng)精神狼瘡患者中也能檢出抗AQ-4抗體,并對神經(jīng)損害起作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院風(fēng)濕科住院患者;49例健康對照者來自作體檢的本院職工,其中男性4例,女性45例,平均年齡35±9.9歲。54例其他風(fēng)濕病患者中包括32例多肌炎/皮肌炎,10例干燥綜合征和12例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者,其中男性6例,女性48例,平均年齡36±9.7歲。105例SLE無神經(jīng)系統(tǒng)累及患者,其中男性9例,女性96例,平均年齡37±6.8歲。103例神經(jīng)精神狼瘡(NPSLE)患者,其中男性7例,女性96例,平均年齡38±8.3歲。

22例非風(fēng)濕病神經(jīng)疾病(非視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化患者)(男性 2例,女性 20例,平均年齡35±8歲)、31例SLE發(fā)熱無神經(jīng)系統(tǒng)累及患者(男性2例,女性29例,平均年齡37±7歲)、96例NPSLE(男性7例,女性 89例,平均年齡 36±9歲)、27例合并結(jié)核感染及8例合并隱球菌腦膜炎的SLE患者(均為女性)檢測了腦脊液檢測抗AQ-4抗體。所有自身免疫病患者均符合各自的診斷分類標(biāo)準;結(jié)核感染依據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室結(jié)核菌培養(yǎng);隱球菌感染根據(jù)細菌學(xué)培養(yǎng)、墨汁染色和乳膠凝集試驗。

1.2 AQ-4抗原肽 由于AQ-4分子是6次跨膜蛋白,有3段短肽在細胞膜外,故我們通過上海華大天源生物科技公司合成了3段肽,第1段AQP4-56-69的序列為CTINWGGTEKPLPVD,第2段AQP4-136-153的序列為 CVTPPSVVGGLGVTMVHGN,第3段AQ4-212-230的氨基酸序列為CMNPARSFGPAVIMGNWENH。

1.3 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗AQ-4抗體 3段肽各500 ng?mL-1混合溶解在0.05 mol?L-1的碳酸緩沖液中,4℃過夜。磷酸緩沖液(PBS)洗板3次,0.1%明膠封閉2 h候后,PBS再洗板3次,再加入100μL腦脊液或1∶100稀釋的外周血清,37℃反應(yīng)1 h,PBS-T洗板3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶10000),洗板后加入TMB顯色液反應(yīng)10min后用2 mol?L-1硫酸終止。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS12.0分析軟件,方差分析統(tǒng)計各組之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 血清抗AQ-4抗體檢測 按照ELISA計算常規(guī),以健康人(對照組)的平均吸光度(OD)+3標(biāo)準差(SD)為臨界值,血清標(biāo)本陽性率在對照組為0%;其他風(fēng)濕病組陽性率為1.8%(1/54);SLE組為14.3%(15/105);NPSLE組為22.3%(23/103)。

2.2 腦脊液抗AQ-4抗體檢測 腦脊液檢出陽性率在對照組為0%;SLE組為12.9%(4/31);NPSLE組為29.2%(28/96);SLE合并結(jié)核性腦膜炎者為37%(10/27);SLE合并隱球菌腦膜炎者為0%(0/8)。

2.3 SLE組和NPSLE組患者的血清和腦脊液中的抗AQ-4抗體顯著增加(P＜0.01),SLE組血清和腦脊液中的抗AQ-4抗體水平相似(P＞0.05)。NPSLE組腦脊液中抗體檢出率(29.2%)較血清中抗體檢出率(22.3%)增高(P＜0.01)。SLE合并TB組腦脊液抗AQ-4抗體的檢出率顯著增高(P＜0.01)。

3 討 論

AQ-4是一種通道蛋白,主要表達在神經(jīng)星型細胞末端的血腦屏障、朗維埃結(jié)節(jié)和跨神經(jīng)突觸,參與水、鉀離子和谷氨酸的轉(zhuǎn)運。我們發(fā)現(xiàn)AQ-4是一種6次跨膜蛋白,其在胞外段的氨基酸序列均較短,故為我們設(shè)計基于肽抗原的間接ELISA檢測方法成為可能。通過抗原分析,我們將AQ-4的A環(huán)的氨基酸序列CTINWGGTEKPLPVD(AA56-69)、B環(huán)的氨基酸序列CVTPPSVVGGLGVTMVHGN(136-153)和 C環(huán)的氨基酸序列 CMNPARSFGPAVIMGNWENH(212-230)設(shè)計為抗原肽?；旌习?建立基于肽抗原的ELISA檢測方法,以方便檢測SLE患者血清和腦脊液中的抗AQ-4抗體。

在血清學(xué)檢測中,抗AQ-4抗體在其他風(fēng)濕病組陽性率為1.8%,在SLE組為14.3%,在NPSLE組為22.3%。在腦脊液組中,對照組為0%,SLE組為12.9%,NPSLE組為29.2%,SLE合并結(jié)核性腦膜炎者為37%,SLE合并隱球菌腦膜炎者為0%?？梢奡LE組和NPSLE組患者的血清和腦脊液中的抗AQ-4抗體顯著增加(P＜0.01),SLE組血清和腦脊液中的抗AQ-4抗體水平相似(P＞0.05)。但NPSLE組腦脊液中抗體檢出率(29.2%)較血清中抗體檢出率(22.3%)增高(P＜0.01)。尤其在SLE合并結(jié)核組的腦脊液中,抗AQ-4抗體的檢出率顯著增高(P＜0.01),結(jié)合AQ-4本身的功能,抗AQ-4抗體可能使血腦屏障破壞,因而導(dǎo)致了SLE患者結(jié)核感染的概率增加。Sellner等[4]對感染相關(guān)的視神經(jīng)脊髓炎進行了分析,發(fā)現(xiàn)與結(jié)核感染相關(guān)的視神經(jīng)病變顯著增加。因此,本研究的發(fā)現(xiàn)提示抗AQ-4抗體是感染與自身免疫之間潛在的橋梁。

我們沒有比較重組AQ-4抗原檢測結(jié)果和肽抗原檢測結(jié)果的相關(guān)性,但以肽段為抗原的檢測結(jié)果已經(jīng)提示抗AQ-4抗體與NPSLE的相關(guān)性。基于我們[5]以往的經(jīng)驗,相信這種檢測方法將會廣泛應(yīng)用于臨床。

1 Lennon VA,Kryzer TJ,Pittock SJ,et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquapo rin-4 water channel[J].J Ex p Med,2005,202(4):473-477.

2 min JH,Kim HJ,Kim BJ,et al.Brain abnormalities in Sjog ren syndrome with recurrent CNS manifestations:association with neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2009,15(9):1069-1076.

3 M ehta LR,Samuelsson MK,Kleiner AK,et al.Neuromyelitis optica spectrum disorder in a patient with sy stemic lupus ery thematosus and anti-phospholipid antibody syndrome[J].Mult Scler,2008,14(3):425-427.

4 Sellner J,Hemmer B,Mühlau M.T he clinical spectrum and immunobiology of parainfectious neuromyelitis optica(Devic)syndromes[J].J Autoimmun,2010,34(4):371-379.

5 葉萍,許桂芳,陳曉翔,等.肽抗原 ELISA檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者抗核糖體蛋白 P抗體的臨床意義[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2006,10:73-76.