HPLC測定蓮房不同炮制品中金絲桃苷和槲皮素的含量

王春麗， 張學(xué)蘭

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355)

蓮房為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。具有化瘀止血的功效?，F(xiàn)代蓮房的炮制方法主要有煅炭［1］和炒炭［2］兩種。研究表明，蓮房中富含黃酮類成分［3］，主要有金絲桃苷、臘梅苷、槲皮素［4］等，但炮制對蓮房中黃酮類成分含量的影響，尚未見報(bào)道?！吨袊幍洹?005版一部僅有蓮房的一般鑒別及檢查方法，而未收載關(guān)于蓮房及蓮房炭的指標(biāo)成分和含量測定方法，這對合理評價(jià)藥材的質(zhì)量造成了一定難度。本研究以金絲桃苷和槲皮素為指標(biāo)，建立同時(shí)測定兩成分的高效液相色譜含量測定方法，并對蓮房生品、煅炭品及炒炭品進(jìn)行比較，為探討蓮房的炮制機(jī)理、優(yōu)選其炮制工藝及控制炮制品的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀(包括DAD二極管陣列檢測器，美國Agilent公司);HP色譜工作站(美國Agilent公司);PM PLUS型紅外測溫儀(美國Raytek公司);JA2003N型電子天平(上海科技儀器公司，精密度為千分之一);FA1604N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，精密度為萬分之一);AF240型電子天平(中國瑞士梅勒公司，精密度為十萬分之一);多星電炒鍋(淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司)。

蓮房購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，經(jīng)本校中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。金絲桃苷、槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號依次為 111521-200303、100081-200406);高效液相用甲醇為色譜純;娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備 生蓮房:取原藥材，除去雜質(zhì)及灰屑，切塊。

煅蓮房炭:按《中國藥典》2010年版一部蓮房項(xiàng)下方法依法炮制［1］。取凈蓮房塊50 g，230℃密閉煅制3 h，放涼，取出。成品表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色。

炒蓮房炭:按《山東省中藥炮制規(guī)范》2002年版蓮房項(xiàng)下方法依法炮制［2］。取凈蓮房塊50 g，用紅外測溫儀測得鍋底溫度為280℃時(shí)投藥，同時(shí)計(jì)時(shí)，以一定頻率翻炒至藥材表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色，出鍋，用時(shí)15 min。

2.2 水分含量測定 取各樣品粉末(過2號篩)約2 g，按《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅸ H水分測定法(烘干法)測定(n=3)，結(jié)果生蓮房、煅蓮房炭和炒蓮房炭的含水量依次為13.14%、6.75%、5.71%。按干燥品計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分的含量。

2.3 金絲桃苷和槲皮素含量測定［5-6］

2.3.1 供試品溶液的制備 取各樣品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品12.65 mg和槲皮素對照品15.68 mg，分別置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得的金絲桃苷和槲皮素的貯備液分別為0.506 mg/mL和0.627 mg/mL。精密吸取金絲桃苷和槲皮素貯備液各10 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.202 mg/mL和0.251 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱:KromasiL C18(5 μm，4.6 mm×200 mm);流動(dòng)相A:0.2%磷酸-水，流動(dòng)相B:甲醇。梯度洗脫:0～15 min，40%B;15～20 min，40% →60%B;20 ～30 min，60%B。柱溫:30℃;流速:1 mL/min;檢測波長:360 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、4.8 mL，置 10 mL 量瓶中，加稀釋液(流動(dòng)相A－流動(dòng)相B配比為60∶40)稀釋至刻度，搖勻，各取20 μL進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程:金絲桃苷 y=20 325x+30.04，r=0.999 9;槲皮素 y=10 907x－25.78，r=0.999 9;結(jié)果表明，金絲桃苷和槲皮素分別在4.04 μg/mL～97.15 μg/mL，5.02 μg/mL ～120.48 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取生蓮房供試品溶液，測定峰面積，結(jié)果金絲桃苷的RSD=1.32%，槲皮素的RSD=1.71%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取生蓮房供試品溶液，在室溫下自然放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 精密吸取 20 μL進(jìn)樣，測定其峰面積，結(jié)果6次測得金絲桃苷和槲皮素的RSD分別為1.63%、1.97%，表明在室溫下12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取生蓮房樣品約1 g，共6份，精密稱定，按2.3.1項(xiàng)下方法制備并測定，結(jié)果測得金絲桃苷和槲皮素含量的RSD分別為1.60%、1.90%。表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，分別代入回歸方程計(jì)算樣品中金絲桃苷和槲皮素的含量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表1。

圖1 混合對照品(A)、蓮房生品(B)、蓮房煅炭品(C)、蓮房炒炭品(D)HPLC圖1.金絲桃苷 2.槲皮素Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances(A)，Nelumbins Receptaculum(B)，calcined product(C)and carbonized product(D).1.hyperin 2.quercetin

表1 蓮房不同炮制品中金絲桃苷和槲皮素含量比較(n=3)Tab.1 Content comparison of hyperin and quercetin in different processed products of Nelumbins Receptaculum(n=3)

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的蓮房生品約0.5 g，平行6份，分別精密加入金絲桃苷對照品溶液(0.506 mg/mL)1.5 mL和槲皮素對照品溶液(0.627 mg/mL)0.5 mL，按供試品溶液的制備方法制備并測定，結(jié)果金絲桃苷和槲皮素的平均回收率分別為 98.76%、97.24%，RSD分別為1.71%、1.94%。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of average recovery

3 小結(jié)和討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定蓮房不同炮制品中金絲桃苷和槲皮素的含量，該方法靈敏度高，所用流動(dòng)相系統(tǒng)和樣品預(yù)處理方法簡單，快速，可用于蓮房飲片的質(zhì)量控制。

3.2 研究結(jié)果表明，蓮房經(jīng)炒炭或煅炭后，金絲桃苷含量下降，而槲皮素含量顯著增加。說明加熱炮制對蓮房中金絲桃苷和槲皮素含量有顯著影響。金絲桃苷的熔點(diǎn)為197～199℃，其苷元為槲皮素，槲皮素熔點(diǎn)為315～317℃，槲皮素對熱較穩(wěn)定，蓮房制炭后槲皮素含量顯著升高，分析可能與金絲桃苷受熱后分解生成槲皮素有關(guān)。

3.3 對提取溶劑進(jìn)行了考察，分別采用60%甲醇、80%甲醇、60%乙醇、80%乙醇作溶劑，對樣品進(jìn)行回流提取，結(jié)果顯示以80%甲醇作為提取溶劑時(shí)，金絲桃苷和槲皮素提取率均較高，故選用80%甲醇提取樣品。

3.4 曾試驗(yàn)用固定流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水的比例(①50:50②45:55③40:60)，對樣品中金絲桃苷和槲皮素的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，① 金絲桃苷出峰時(shí)間太短，易與溶劑峰混淆;② 出峰時(shí)間適宜，生品分離效果較好，但炭品存在基線漂移、金絲桃苷色譜峰分離度達(dá)不到要求的情況;③兩種成分分離度較好，基線平穩(wěn)，但槲皮素出峰時(shí)間太長。而用0.2%磷酸水-甲醇梯度洗脫測定樣品中金絲桃苷和槲皮素的含量，出峰時(shí)間短，峰形較好，且穩(wěn)定，無其他成分干擾。

3.5 蓮房生品化瘀之力偏盛，止血力較弱，多用于胎衣不下，痔瘡及產(chǎn)后惡露不絕;制炭后收澀力增強(qiáng)，常用于崩漏，尿血，痔血等下部出血癥［7］?，F(xiàn)代研究表明，槲皮素具有止血作用，能明顯縮短小鼠的出血時(shí)間［8］。蓮房制炭后止血作用增強(qiáng)分析與槲皮素含量增加有關(guān)，蓮房中是否還有其他止血成分有待于進(jìn)一步研究。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:257.

［2］山東省藥品監(jiān)督管理局.山東省中藥炮制規(guī)范［M］.濟(jì)南:山東友誼出版社，2002:234-235.

［3］郭 明，楊群超，朱靈芝，等.荷花不同部位總黃酮分布及荷葉黃酮提取工藝研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(3):213.

［4］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:405-406.

［5］中國藥典［S］.一部.2005:84.

［6］雍國新.荷葉中槲皮素提取工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(14):5705-5706.

［7］龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:129.

［8］Ishida H，Umino T，Tsuji K，et al.Studies on the antihemostatic substances in herbs classified as Hemostatics in traditional Chinese Medicine.I.on the antihemostatic principles in Sophora japonica L.［J］.Chem Pharm Bull，1989，37(6):1616-1618.