尿毒清顆粒改善鏈佐星-弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型腎臟功能的研究

李 璇， 王 瓊， 何 寶， 孫雪瑩， 孫小玉， 李曉冬， 朱 荃(南京中醫(yī)藥大學(xué)國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇南京210029)

DN是糖尿病最嚴重的微血管病變之一，嚴重影響糖尿病病人生存健康，終末期腎病中有1/3是由糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)展而來的［1］。蛋白尿和腎小球濾過率(glomerilar filtration rate，GFR)是評價腎臟功能及其改變的主要指標。微量白蛋白尿的出現(xiàn)標志著DN的開始，而持續(xù)的蛋白尿則是判定DN及其嚴重程度的指標。Ccr可用肌苷清除率(creatinine clearance rate，Ccr)來衡量［2］。腎小球基底膜增厚，腎小球胞外基質(zhì)增寬是DN最主要的病理學(xué)改變［3］，所以腎小球損害是DN發(fā)生發(fā)展過程中最重要的環(huán)節(jié)。

尿毒清顆粒是廣州康臣藥業(yè)公司上市十年的以尿毒癥為主治的中藥復(fù)方制劑，主要由大黃、黃芪、甘草、茯苓、白術(shù)、制何首烏、川芎、菊花、丹參、姜半夏組成，具有通腑降濁，健脾利濕，活血化瘀的功效。但尚未見到該制劑對DN的影響的報道。本實驗以鏈佐星(Streptozotocin，STZ)－弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)誘導(dǎo)大鼠 DN模型，觀察尿毒清顆粒對的DN的改善作用及其可能的機制，探討該制劑用于DN治療的可能性。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 尿毒清顆粒，廣州康臣藥業(yè)有限公司;STZ，CFA，山梨出脫氫酶，D－山梨醇，sigma;優(yōu)越血糖試紙，美國羅氏診斷公司;葡萄糖、尿素氮、肌酐、SOD、MDA、考馬斯亮蘭測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;尿白蛋白測定試劑盒，南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所;NADH，中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司;甘氨酸，上?？颠_氨基酸廠;IV型膠原，CHEMICON International Inc;二抗，晶美生物工程有限公司;DAB顯色系統(tǒng)，Gene Tech Biotechnology Company Limited;枸櫞酸、枸櫞酸鈉等化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 動物與儀器 SPF級Wistar大鼠，♂性，體重160～180 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號:SCXK(滬)2003－0003;Accu－Chek Advantage血糖儀，美國羅氏診斷公司;SPECTRAmax190，美國Molecular Devices Corporation;Spectra MAX GEMINIXS，美國 Molecular Devices Corporation。

2 實驗方法

大鼠70只，隨機分為兩組，正常對照組10只，造模組60只，動物自由飲水、進食，參考文獻方法［4］制作DN大鼠模型。造模合格動物40只分為:模型組，尿毒清顆粒0.6、1.8、5.4 g/kg組，每組10只，使組間血糖值無差異，正常對照組不變。藥物組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，同體積不同濃度給藥，模型組給予同體積生理鹽水，每日一次，連續(xù)14周;造模組飼以10%高脂飼料，正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)。

樣本采集及指標檢測:實驗結(jié)束后，單籠收集24 h尿液，測定尿液體積、總蛋白、白蛋白水平并計算24 h總蛋白和白蛋白排出量;秤體重，取血，分離血清，測定葡萄糖、尿素氮、肌酐、糖基化終產(chǎn)物(AGE)、SOD、MDA;分離紅細胞，制成50%紅細胞懸液，反復(fù)3次凍融破膜，按體積比1:2加入無水乙醇沉淀蛋白，3 000 r/min離心，上清－20°C凍存，用于測定紅細胞內(nèi)山梨醇含量;取兩側(cè)腎臟，稱重，一側(cè)制成20%腎勻漿，亦按上述方法沉淀蛋白、保存，用于測定腎臟中山梨醇含量;另一側(cè)腎臟置10%福爾馬林溶液中固定，脫水，石臘包埋，常規(guī)HE及PAS染色，光學(xué)顯微鏡觀察病變并評分，腎臟病變包括(1)腎小球系膜基質(zhì)增生程度;(2)腎小管有無變性;(3)腎小管有無糖原沉積;(4)間質(zhì)及腎盂有無炎癥、纖維組織增生及其嚴重程度。參照Bilous［5］分級方法，根據(jù)病變由輕到重的程度分別標記為1分、2分、3分、4分，無病變者記為0分，累加系膜基質(zhì)增生及腎小管內(nèi)糖原沉積所得分數(shù)，并計算出每組均分，分值越高提示DN病變程度越高;OPTAMS軟件分析PAS染色切片紫紅色占腎小球面積百分比;免疫組化法檢測Collanges IV表達并以O(shè)PTAMS軟件作圖像分析，計算棕黃色表達部位的面積占腎小球面積的百分比:

山梨醇與AGE含量的測定:

參照 Gupta［6］方法，取樣本 100 μL 加入 Spectra MAX GEMINIXS專用黑色96孔板中，再加入酶反應(yīng)液(0.2 mol/L甘氨酸－NaOH緩沖液(pH 9.4)含8 U山梨醇脫氫酶和0.6 mmol/L NAD+)100 μL，37°C保溫30 min，367/455 nm(激發(fā)光/發(fā)射光)測定熒光值，并代入標準曲線換算，計算出待測樣品種山梨醇的含量。參照Munch［7］方法測定AGE水平。

酶法測定山梨醇標準曲線的繪制:配制濃度為2.5×10－4mol/L山梨醇溶液，并分別稀釋至如下濃度:1.25 × 10－4mol/L、2.5 × 10－5mol/L、1.25 ×10－5mol/L、6.25 ×10－6mol/L。各濃度山梨醇標準液各取100 μL，如上法測定，并繪制標準曲線。

肌酐清除率的計算:肌酐清除率(Ccr)=尿肌酐×每分鐘尿量(ml)/血肌酐，以體重校正。

3 結(jié)果

3.1 尿毒清顆粒對STZ－CFA聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠DN模型體重、進食量的影響 如圖1所示，模型組動物體重明顯降低，進食量明顯增加。尿毒清顆粒對DN大鼠體重沒有明顯影響，但可明顯減少大鼠的進食量。

3.2 尿毒清顆粒對STZ－CFA誘導(dǎo)的DN動物模型大鼠尿液指標的影響 如表1可見，模型組動物24 h尿量、總蛋白和白蛋白排出量增加;尿毒清顆粒1.8 g/kg、5.4 g/kg可明顯減少DN大鼠24 h尿量，降低24小時總蛋白和白蛋白的排出量。未觀察到尿毒清顆粒0.6 g/kg對上述指標有明顯影響。

圖1 尿毒清顆粒對STZ-CFA誘導(dǎo)的DN模型體重(A)、攝食量(B)的影響

表1 尿毒清對DN大鼠24 h尿量、總蛋白、

3.3 尿毒清顆粒對STZ－CFA誘導(dǎo)的大鼠DN模型生化指標的影響 DN動物血糖明顯升高，尿毒清顆粒1.8 g/kg、5.4 g/kg給藥11周可后可降低DN大鼠血糖;DN大鼠血清丙二醛(MDA)、血肌酐、血尿素氮、糖基化終產(chǎn)物(AGEs)水平顯著升高，超氧化物歧化酶(SOD)顯著降低。尿毒清顆粒1.8 g/kg、5.4 g/kg可明顯降低總膽固醇、MDA、血肌酐、血尿素氮、AGEs、LDL水平，提高血清SOD活性(表2、表3)。

3.4 尿毒清顆粒對STZ－CFA誘導(dǎo)的DN大鼠Ccr、腎指數(shù)及山梨醇含量的影響 DN大鼠肌酐清除率明顯降低，腎臟重量、腎指數(shù)、紅細胞及腎臟勻漿中山梨醇含量明顯增高;尿毒清顆粒1.8 g/kg、5.4 g/kg能顯著增加DN大鼠肌酐清除率，減輕腎臟重量、降低腎指數(shù)及紅細胞、腎勻漿中的山梨醇含量，尿毒清顆粒0.6 g/kg可明顯降低紅細胞內(nèi)山梨醇的含量，未觀察到對其他指標有明顯影響(表4)。

表2 尿毒清顆粒對DN大鼠血糖的影響(n=10，±s)

表2 尿毒清顆粒對DN大鼠血糖的影響(n=10，±s)

注:1、3、7、11周血糖值由羅氏公司血糖儀及試紙條測出，14周血糖值由葡萄糖試劑盒測出。*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比。

組別 劑量/(g/kg)給藥期血糖/(mmoL/L)1周 3周 7周 11周 14周對照 － 4.6±0.4** 4.6±0.5** 4.7±0.5** 4.9±0.8** 4.9±1.0**模型 － 25.3±4.7 22.3±3.5 25.0±6.1 22.9±3.4 19.5±2.0尿毒清 0.6 25.4±5.0 21.8±3.9 25.8±5.5 23.1±5.6 19.1±2.4顆粒 1.8 25.0±4.8 22.1±6.8 19.7±9.0 19.8±3.1* 17.7±1.5*5.4 24.7±4.7 22.4±6.6 21.6±9.0 19.0±3.7* 17.2±2.3*

表3 尿毒清對DN大鼠血清生化指標的影響(n=10，±s)

表3 尿毒清對DN大鼠血清生化指標的影響(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比。

劑量SODMDA血肌酐 血尿素氮AGEs組別 /(g/kg)/(U/mL)/(nmol/L)/(umol/L)/(mmol/L)/U對照 － 525±26** 4.4±0.7** 71.7±19.2** 6.5±0.7** 264±53**模型 － 481±25 9.3±2.6 96.3±13.4 7.9±1.3 351±59尿毒清 0.6 498±33 7.8±2.3 91.0±31.1 7.0±1.0 290±59顆粒 1.8 513±41* 6.8±1.9* 76.6±24.5* 6.6±1.2* 289±56*5.4 520±29** 6.8±1.3* 75.2±17.1** 6.5±1.5* 281±78*

表4 尿毒清顆粒對DN大鼠體重、腎臟重量、腎指數(shù)、紅細胞和腎臟中山梨醇含量的影響(n=10，±s)

表4 尿毒清顆粒對DN大鼠體重、腎臟重量、腎指數(shù)、紅細胞和腎臟中山梨醇含量的影響(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比。

組別 劑量/(g/kg)腎臟重量/g 腎指數(shù)紅細胞山梨醇含量/(μmol/L)腎勻漿山梨醇含量(μmol/L)Ccr/(mL/min/100 g )對照 － 2.02±0.13** 0.52±0.03** 4.85±1.37** 19.89±5.56* 0.298±0.118*模型 － 2.22±0.18 0.90±0.10 17.98±5.30 28.41±8.01 0.187±0.082尿毒清 0.6 2.16±0.25 0.81±0.15 10.36±2.58** 26.47±8.67 0.271±0.211顆粒 1.8 2.04±0.16* 0.71±0.11** 10.20±2.30** 25.71±7.71 0.374±0.179*5.4 2.07±0.12* 0.74±0.12** 5.99±1.94** 21.91±3.24* 0.428±0.240*

3.5 尿毒清顆粒對STZ－CFA誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟病理及Ⅳ型膠原表達的影響 采用腎臟病變程度綜合評分和IV型膠原表達作為藥物干預(yù)DN病理學(xué)變化的評價指標。腎臟病理學(xué)研究表明，本研究成功地復(fù)制了DN模型。表現(xiàn)為(1)腎小球呈分葉狀，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增多，HE染色時呈深伊紅染，PAS染色呈陽性反應(yīng)。(2)腎小管病變表現(xiàn)為上皮細胞空泡變，PAS呈輕度陽性反應(yīng)。(3)腎皮質(zhì)、髓質(zhì)交界處小血管管壁增厚，和/或伴有血管壁空泡變，符合DN的病理學(xué)特征，同時，腎臟Ⅳ型膠原表達明顯增多。尿毒清顆粒1.8 g/kg、5.4 g/kg明顯改善DN的病理學(xué)變化，減少Ⅳ型膠原表達量，而0.6 g/kg無明顯改善作用(如圖2和表5所示)。

表5 尿毒清顆粒對DN模型腎臟IV型膠原的表達和病理學(xué)評分的影響(n=10，±s)

表5 尿毒清顆粒對DN模型腎臟IV型膠原的表達和病理學(xué)評分的影響(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比。

組別 劑量/(g/kg)/%對照 － 8.1±1.9** 0.3±0.5** 22.1±4.4 IV型膠原/%病理評分PAS染色評分**模型 － 21.7±2.9 3.4±1.3 36.2±3.6尿毒清 0.6 19.1±3.4 2.7±1.0 33.1±5.1顆粒 1.8 14.5±4.9** 1.8±1.3* 29.8±5.6**5.4 14.8±4.5** 1.6±1.1** 27.0±5.5**

圖2 尿毒清顆粒對DN大鼠模型腎臟病理學(xué)及Ⅳ型膠原表達的影響

4 討論

不論是DN還是其他類型的腎病，蛋白尿與腎病的進展密切相關(guān)。蛋白尿是腎小球血管內(nèi)皮細胞損傷的標志，它反映了腎小球血管發(fā)生了早期硬化及慢性炎癥病變，因而表現(xiàn)為白蛋白可以從血管滲漏［8］。蛋白尿和微白蛋白尿的出現(xiàn)對于患者來說意味著可能出現(xiàn)的嚴重后果甚至導(dǎo)致死亡。尿毒清顆粒可明顯降低24 h總蛋白和白蛋白排出量，提高Ccr，而表現(xiàn)出改善DN的效應(yīng)。

AGEs的聚積和多元醇通路的激活是糖尿病并發(fā)癥的重要發(fā)病機制。抑制AGEs的生成、阻斷其病理損害已經(jīng)成為治療DN藥物研究的熱門靶點［9］。山梨醇是多元醇通路的中間產(chǎn)物，檢測組織中山梨醇的含量，能有效反應(yīng)該組織中多元醇通路的激活狀態(tài)。糖尿病狀態(tài)下，山梨醇在細胞內(nèi)不斷聚集，NADPH量減少，導(dǎo)致細胞內(nèi)滲透壓增加，細胞水腫，肌醇、K+、氨基酸等消失，還原型谷胱甘肽減少，氧化應(yīng)激增強，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)損害，代謝與功能紊亂，產(chǎn)生組織細胞病變［10，11］。Oishi等日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者紅細胞內(nèi)多元醇代謝產(chǎn)物山梨醇的濃度與糖尿病白內(nèi)障并發(fā)癥的病變程度正相關(guān)，提供了一個方便檢測多元醇代謝的方法［12］。本實驗采用熒光法測定動物血清AGEs的水平，微量酶促反應(yīng)測定動物紅細胞及腎組織內(nèi)山梨醇水平，結(jié)果表明，尿毒清顆粒減少 DN大鼠AGEs在體內(nèi)的聚積，抑制多元醇通路的激活，這有可能是其改善DN的上游因素。

氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制的核心環(huán)節(jié)。它激活了幾乎所有的糖尿病并發(fā)癥有關(guān)的病理通路。更為嚴重的是，伴隨著過氧化產(chǎn)物的堆積，同時產(chǎn)生了大量的強氧化劑－氧化一氮(nitric oxide)，后者又激活了腺苷二磷酸核糖聚合酶，損傷血管內(nèi)皮細胞功能，激發(fā)了血管炎癥，進一步加重了糖尿病并發(fā)癥的病理演變。抗氧化治療已經(jīng)受到了糖尿病學(xué)者們密切注意，啟動了藥物研究計劃［13］。本研究測定了與氧化應(yīng)激相關(guān)的指標，結(jié)果表明，尿毒清顆粒能夠改善DN大鼠氧化還原失衡狀態(tài)。如前所述，AGEs的聚積和多元醇通路激活可引起活性氧簇的過多產(chǎn)生，而尿毒清顆粒對這兩條通路的抑制作用也是其產(chǎn)生抗氧化作用的重要機制。

DN以腎小球和小管上皮細胞的過度肥大、腎小球和小管基底膜增厚、胞外基質(zhì)蛋白聚集為特征。胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)是一個動態(tài)的過程，包括合成和降解，這個過程的不平衡會導(dǎo)致基質(zhì)的聚集乃至漸進的腎小球硬化。胞外基質(zhì)是由幾種蛋白成分構(gòu)成的，IV型膠原是其主要結(jié)構(gòu)成分之一，DN時IV型膠原表達增多。本文以HE和PAS兩種染色方法觀察了腎小球的病理變化，免疫組織化學(xué)的方法觀察腎小球IV型膠原的表達量，結(jié)果表明尿毒清顆粒可降低PAS染色評分及病理學(xué)評分，改善模型動物腎臟基質(zhì)增生、系膜區(qū)增大的病變情況，減少腎小球Collagen IV的表達。

綜上所述，尿毒清顆粒明顯改善DN模型的腎臟功能，主要表現(xiàn)為減少尿液中白蛋白的排出，提高肌苷清除率，減輕腎臟病理學(xué)改變，這與其抑制AGEs聚積和山梨醇通路的激活，糾正機體的氧化還原失衡，抑制IV型膠原的表達的作用有關(guān)。

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