分子光譜法研究恩替卡韋和牛血清白蛋白之間的相互作用

吳云華

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

研究藥物分子與血清白蛋白之間的相互作用對于研究藥物代謝學(xué)以及蛋白質(zhì)構(gòu)象學(xué)具有重要意義[1,2].恩替卡韋(2-氨基-9-[(1S,3R,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1,9-二氫-6-嘌呤-6-酮;分子式C12H 15N 5O3;分子量277.28.化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種有效的、選擇性抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的核苷類似物,由美國百時(shí)美施貴寶公司自主研發(fā),FDA于2005年批準(zhǔn)它用于慢性乙肝類型的治療[3].本文采用紫外-可見光譜法、熒光光譜法和圓二色光譜法研究恩替卡韋與BSA的結(jié)合作用,確定了熒光猝滅機(jī)理,測定了結(jié)合反應(yīng)的各種常數(shù),探討了恩替卡韋與BSA構(gòu)象的影響以及結(jié)合作用機(jī)理.

圖1 恩替卡韋化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structu re o f en tecav ir

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光光度計(jì)(日本日立公司);J-810圓二色光譜儀(日本分光JA SCO 公司);UV 757CRT紫外可見分光光度計(jì);pHS-3C精密pH計(jì).

9.02×10-3m o l/L恩替卡韋儲(chǔ)備液的配置:準(zhǔn)確稱取恩替卡韋0.010 g,用4m L甲醇溶解;5.45×10-5m o l/L BSA儲(chǔ)備液的配置:準(zhǔn)確稱取BSA 180 m g,用50m L的高純水配置,儲(chǔ)存在4℃冰箱中;緩沖溶液(pH=6.90)的配置:將 1/15 m o l/L N aH2PO4與1/15m o l/L N a2HPO4配置為VN aH 2PO4∶

VNa2HPO4=4∶6;所用試劑均為分析純,水為二次蒸餾水.

1.2 試驗(yàn)方法

在10m L熒光杯中加入一定體積的BSA儲(chǔ)備液,再加入適量的恩替卡韋溶液,用緩沖液定容至10 m L,分別測25,35,45℃的熒光猝滅光譜.固定激發(fā)波長在280 nm,掃描混合物在220～450 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜.340 nm處的發(fā)射熒光強(qiáng)度用于定量分析.固定波長差Δλ=15和60 nm,做同步掃描熒光光譜.掃描BSA以及BSA與恩替卡韋混合液,在220～450 nm 范圍內(nèi)的紫外-可見光譜.掃描BSA 以及BSA與恩替卡韋混合液,在190～350 nm范圍的圓二色譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 恩替卡韋和BSA的結(jié)合物常數(shù)K和結(jié)合數(shù)n

2.1.1 紫外-可見吸收光譜

在pH 6.9磷酸鹽緩沖液中,將BSA和恩替卡韋按比例混合后測量250～350 nm紫外-可見光吸收光譜(見圖2).圖2中保持曲線1～3的BSA 的濃度不變,恩替卡韋濃度不斷增加,光譜顯示BSA在280 nm處有最大吸收峰,BSA的吸收峰隨著恩替卡韋濃度的增加而升高,但最大吸收峰位置不變;曲線4為不加入BSA,僅含恩替卡韋紫外光吸收譜,在280 nm處未顯示峰,表明此處的吸收峰為BSA吸收峰.

圖2 BSA和恩替卡韋的紫外光吸收光譜Fig.2 A bso rp tion spectra of entecavir bound to BSA atpH 6.9

2.1.2 恩替卡韋對BSA熒光光譜的影響及猝滅機(jī)理

不同濃度恩替卡韋對BSA熒光光譜影響見圖3.隨著恩替卡韋濃度的增大,BSA的熒光光譜呈規(guī)律性降低,表明二者之間有可能形成了復(fù)合物.隨著恩替卡韋濃度的增大,復(fù)合物的最大發(fā)射波長藍(lán)移,表明BSA中生色氨基酸殘基的疏水環(huán)境可能發(fā)生了改變.

動(dòng)態(tài)猝滅因猝滅及分子和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子間相互碰撞而導(dǎo)致熒光猝滅,其猝滅隨著溫度升高而加強(qiáng);而靜態(tài)猝滅因猝滅劑分子和熒光物質(zhì)分子之間形成了非熒光的復(fù)合物,其猝滅隨溫度升高而減弱;假設(shè)該猝滅過程是動(dòng)態(tài)猝滅,應(yīng)該滿足Stern-V o lm er方程[4],即:

式中,F0和F分別為不加入和加入恩替卡韋時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅速率常數(shù);Ksv為動(dòng)力猝滅常數(shù);τ0為猝滅劑分子不存在時(shí)熒光物質(zhì)分子的壽命(生物大分子熒光壽命約為10-8s);Q為猝滅劑的濃度.

圖3 不同濃度恩替卡韋對BSA熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effectof en tecaviron fluo rescence spectra of BSA

根據(jù)不同溫度下的熒光猝滅光譜,計(jì)算出3個(gè)溫度下的Ksv和Kq(見圖4和表1).生物大分子動(dòng)態(tài)猝滅過程的最大Kq=2.0×1010L/(m o l·s),Ksv隨溫度升高而減小.比較試驗(yàn)結(jié)果可知:恩替卡韋猝滅BSA熒光的過程為靜態(tài)猝滅過程.

圖4 不同溫度下的恩替卡韋與牛血清白蛋白猝滅的Stern-Vo lm er圖Fig.4 Stern-Vo lm er curvesof quench ing of BSA w ith en tecavir at various tem peratu res

表1 不同溫度下的Stern-V o lm erTab.1 Stern-Vo lm er quench ing constan tso f en tecacir to BSA at various tem peratu res

2.1.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

對于靜態(tài)猝滅,熒光強(qiáng)度和猝滅劑濃度之間的關(guān)系為[5]

式中,KA為結(jié)合常數(shù).lg(F0-F)/F對lgQ作圖,所得直線的斜率是結(jié)合位點(diǎn)n,截距為lgKA.根據(jù)熒光猝滅實(shí)驗(yàn),分別得到25,35,45℃下的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(見圖5和表2).數(shù)據(jù)表明,結(jié)合物常數(shù)隨溫度的增加而減少,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本不隨溫度變化.說明恩替卡韋在BSA的某個(gè)位點(diǎn)上通過一種強(qiáng)的結(jié)合作用和BSA形成了復(fù)合物.

圖5 不同溫度下的雙對數(shù)圖Fig.5 Plo to f lg(F0-F)/F vs.lg[Q]fo r quench ing o f en tecavir to BSA at various tem peratu res

表2 恩替卡韋和BSA作用時(shí)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)Tab.2 B ind ing constan ts and the b ind ing num bers o f En ticavir and BSA at d ifferen t tem peratu res

2.2 恩替卡韋和BSA作用距離的計(jì)算

根據(jù)Fo rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[6],當(dāng)供體發(fā)熒光時(shí),供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有足夠的重疊,供體與受體的最大距離不超過7 nm,能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體間距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0存在式(1)關(guān)系.

式(1)中,k為供體-受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的取向因子;n為介質(zhì)的折射指數(shù);Φ為供體的熒光量子產(chǎn)率,J為供體的熒光發(fā)射光譜和受能體的吸收光譜之間的光譜重疊積分,即

式(3)中,F(λ)為供體在波長為λ時(shí)的熒光強(qiáng)度;∈(λ)為受體在波長λ時(shí)摩爾吸光系數(shù).

BSA熒光光譜與恩替卡韋紫外吸收光譜的重疊圖譜見圖6.根據(jù)式(3),將圖6中290～450 nm 光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和,得到光譜的重疊積分J=1.16×10-14cm3·L/m o l.

在上述實(shí)驗(yàn)條件下,取向因子用供體-受體各向隨機(jī)分布的平均值K=2/3,折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值n=1.336,Φ=0.118.將上述值代入式(2),求得R0=2.6 nm.結(jié)合式(1),得到r=2.7 nm(25℃).供體-受體之間的距離小于7 nm,表明BSA容易向恩替卡韋發(fā)生能量轉(zhuǎn)移.

圖6 恩替卡韋的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜Fig.6 O verlap of theUV spectrum of en tecavirw ith the fluo rescence em ission spectrum of BSA

2.3 作用力類型的確定

藥物小分子和生物大分子間的相互作用力可為氫鍵或范德華力、靜電作用力和疏水作用力.根據(jù)Ross理論[7],結(jié)合作用力類型可通過結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)變化確定:ΔH＞0,ΔS＞0時(shí)為疏水作用力;ΔH＜0,ΔS＞0時(shí)為氫鍵或范德華力;ΔH＜0,ΔS＞0時(shí)為靜電作用力.恩替卡韋和BSA結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)滿足式(3)～ (5)關(guān)系.

由恩替卡韋和BSA在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka可求得結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)(見表3).ΔG＜0時(shí)結(jié)合反應(yīng)為自發(fā);ΔH＞0,ΔS＞0時(shí)結(jié)合作用力類型為疏水作用力,熵變化驅(qū)動(dòng)該結(jié)合反應(yīng)而焓變化不利于該結(jié)合反應(yīng).

表3 恩替卡韋和BSA結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Therm odynam ic param eterso f En ticavir-BSA system

2.4 恩替卡韋對BSA構(gòu)象的影響及結(jié)合機(jī)理

2.4.1 同步熒光光譜

蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸和酪氨酸殘基.同步熒光光譜法用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的分析,主要基于Δλ的變化考察.當(dāng)Δλ=15 nm 時(shí),所得同步熒光光譜僅顯示酪氨酸殘基特征熒光;Δλ=60 nm 時(shí),所得同步熒光光譜只顯示色氨酸殘基特征熒光.而色氨酸和酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境緊密相關(guān),因而可以此考察蛋白質(zhì)構(gòu)象變化情況.固定BSA的濃度,逐漸增加恩替卡韋的濃度,以Δλ=15 nm和60 nm掃描BSA的同步熒光光譜(見圖7).

圖7 不同濃度的恩替卡韋對BSA同步熒光光譜的影響Fig.7 Synch ronous fluo rescen t spectra o f BSA in the p resence of entecavir

由圖7知,隨著恩替卡韋濃度的增加,酪氨酸殘基熒光強(qiáng)度變化較小,色氨酸熒光強(qiáng)度明顯降低,但峰位置基本無變化,說明恩替卡韋的加入主要改變了BSA中色氨酸殘基附近的微環(huán)境,色氨酸所處微環(huán)境的疏水性降低,表明BSA內(nèi)部的疏水腔結(jié)構(gòu)有所瓦解,肽鏈的伸展程度有所增加,從而推斷出BSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化.

2.4.2 圓二色譜光譜

CD光譜法是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的有效手段.BSA以及BSA與恩替卡韋相互作用的CD光譜見圖8.單純的BSA溶液顯示出了BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的3個(gè)特征峰,192 nm處1個(gè)正峰,208,222 nm處2個(gè)負(fù)峰.加入恩替卡韋后,原208,222 nm 處的負(fù)峰也略微移向低波數(shù)且振幅減弱顯著.CD光譜的測定結(jié)果根據(jù)公式可轉(zhuǎn)化為平均殘基橢圓率(M RE/(deg cm2/dm o l)).

式(6)中:cp為BSA的摩爾濃度,n為BSA的氨基酸殘基數(shù)目,l為測定池的厚度.根據(jù)式(7)求出單純的BSA及與恩替卡韋相互作用BSA的α-螺旋結(jié)的比例度

圖8 恩替卡韋和BSA CD光譜圖Fig.8 CD spectra of the BSA-entecavir system

式(7)中:M RE208為BSA 在208 nm 的M RE,4 000為BSA在208 nm的β-折疊以及無規(guī)卷曲的M RE,33 000為BSA 在208 nm 純粹α-螺旋的M RE.

根據(jù)式(6)和(7)求得單純的BSAα-螺旋結(jié)構(gòu)的比例為86.2%,與恩替卡韋相互作用BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例減小到77.7%,說明恩替卡韋溶液與BSA的結(jié)合反應(yīng)的主要作用力類型為疏水力作用,使BSA肽腱伸展,改變了BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少.由此可知恩替卡韋與BSA的相互作用以疏水作用為主[8],與熒光測得結(jié)果相符.

3 結(jié)論

恩替卡韋對BSA熒光的猝滅機(jī)制屬靜態(tài)猝滅過程,在25,35,45℃下,恩替卡韋和BSA之間的Ka分別為9.13×103,7.96×103,5.46×102L/m o l,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.781,0.780,0.751.結(jié)合反應(yīng)的主要作用力類型為疏水作用力.恩替卡韋與BSA之間的結(jié)合距離為2.7 nm(25℃).BSA與恩替卡韋結(jié)合位點(diǎn)接近BSA的Th r色氨酸殘基.

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