微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)大豆分離蛋白凝膠性的影響

何冬蘭,彭寶玉,張 瑩,歐陽(yáng)林蘭

(中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074)

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)大豆分離蛋白凝膠性的影響

何冬蘭,彭寶玉,張 瑩,歐陽(yáng)林蘭

(中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074)

利用Strep toverticilliumsp.CJ3033菌株發(fā)酵得到發(fā)酵液,經(jīng)過(guò)濾、離心、冷凍濃縮、乙醇沉淀和冷凍干燥后,制得的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶粗酶作用于大豆分離蛋白,利用物性分析儀研究了MTG對(duì)大豆分離蛋白形成凝膠的特性及持水性的作用.通過(guò)二次回歸正交組合設(shè)計(jì)的方法研究了MTG的添加濃度、作用時(shí)間、處理溫度對(duì)SPI凝膠形成及保水性的影響,結(jié)果顯示:MTGase對(duì)大豆分離蛋白有顯著改善作用,在51℃、反應(yīng)1.5 h、酶濃度9.82 U/g時(shí),SPI的凝膠強(qiáng)度最大,達(dá)74.95 g/mm2;在49℃、反應(yīng)1.3 h、酶濃度7.78 U/g時(shí),SPI的持水率為96.47%.

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶;大豆分離蛋白;凝膠強(qiáng)度;持水性

大豆分離蛋白(Soybean Protein Isolate,SPI)主要用于食品生產(chǎn)的原料或添加劑,改善食品的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì).因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的功能性質(zhì),已被廣泛應(yīng)用于食品加工各個(gè)領(lǐng)域.SPI本身雖具有一定的功能,但理想與否,需通過(guò)各種物理、化學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行改性和修飾,從而使其功能性質(zhì)得到顯著改善,以滿足市場(chǎng)需求[1].

響應(yīng)面分析法(Response SurfaceM ethodology,RSM),由一組數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組成,可用于確定各因素及其交互作用在加工過(guò)程中對(duì)非獨(dú)立變量的影響,精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系,是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法,由于其合理的設(shè)計(jì)和優(yōu)良的結(jié)果,已被越來(lái)越多的生物工程行業(yè)工作者采用[2].但目前還沒(méi)有應(yīng)用該方法研究谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)大豆分離蛋白形成凝膠的影響的報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)采用酶法對(duì)植物蛋白SPI進(jìn)行改性,采用響應(yīng)面分析法對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)大豆分離蛋白凝膠性能及保水性的影響因素進(jìn)行優(yōu)化,以獲得性能較好同時(shí)保水性亦好的凝膠,對(duì)SPI的工業(yè)化轉(zhuǎn)化有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義,同時(shí)為T(mén)Gase進(jìn)一步在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆分離蛋白(SPI):購(gòu)自天福園綠色健康產(chǎn)業(yè)有限公司;菌種:Strep toverticilliumsp.CJ3033,由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 主要試劑和儀器

Nα-CBZ-Gln-Gly;L-glutam ic acid-r-monohydroxamate均購(gòu)自Sigma公司;MTG作用于SPI后,利用TA.XT Plus物性測(cè)試儀(LLOYD英國(guó)勞埃德儀器公司)對(duì)SPI的凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定.

1.2 方法

1.2.1 酶液的制備

菌種活化后轉(zhuǎn)接至含25 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中,于30℃、200 r/m in培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接至10 L發(fā)酵罐發(fā)酵,接種量為5%～10%(體積比),于30℃、罐壓0.02～0.03 M Pa、攪拌轉(zhuǎn)速250 r/m in、pH 7.0～ 7.5、通氣量 0.06 vvm(m3/(m3·m in))條件下發(fā)酵2.5 d,發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、真空泵抽濾、離心(4℃、12 000 r/m in,離心15 m in)得到發(fā)酵酶液,發(fā)酵酶液經(jīng)真空冷凍干燥、乙醇沉淀、蒸餾水懸浮、冷凍干燥得到酶粉,-20℃貯存?zhèn)溆?

1.2.2 MTGase酶活測(cè)定

按照Grossw icz等方法[3]進(jìn)行,以CBZ-Gln-Gly、鹽酸羥胺為底物,以37℃催化形成氧肟酸1 μmol/m in所得酶量定義為一個(gè)酶活單位.

1.2.3 二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)(響應(yīng)面分析法)[4-8]

以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和酶活性為影響因素,各設(shè)5個(gè)水平(見(jiàn)表1).

表1 因素水平編碼表Tab.1 Factors and levels of testing

按表2進(jìn)行正交試驗(yàn)(正交試驗(yàn)組合共安排20組,其中8組正交實(shí)驗(yàn),6組星號(hào)實(shí)驗(yàn),6組零水平實(shí)驗(yàn)).

1.2.4 SPI凝膠性測(cè)定

利用10%(質(zhì)量/體積)的SPI溶液按表2組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn).反應(yīng)完畢后用保鮮膜封口,90℃下處理30 m in后于4℃冰水中迅速冷卻,最后置于4℃冰箱中保存16 h.16 h后采用TA.XT2物性測(cè)試儀,用穿刺實(shí)驗(yàn)法測(cè)定.

室溫下采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn),探頭為P/0.5平端柱形探頭,軸向壓縮2次/樣品,壓縮比45%;測(cè)試前速度5.0mm/s,測(cè)試速度3mm/s,測(cè)試后返回速度3 mm/s;中間間隔5 s,測(cè)試總時(shí)間150 s.

凝膠強(qiáng)度定義:單位面積凝膠破裂所需的力(g).

表2 MTGase處理正交表Tab.2 O rthogonal table onMTG treatment

1.2.5 SPI持水性測(cè)定

用餐巾紙拭去凝膠表面的水分,按下式計(jì)算各組的持水量:

W HC=1-(W1-W2)/(W1-W0),其中,W0為燒杯重量,W1為酶反應(yīng)前燒杯和酶溶液總重,W2為酶反應(yīng)后燒杯和SPI凝膠總重.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活測(cè)定結(jié)果

根據(jù)L-谷氨酸γ-單羥肟酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,500 nm吸光值與氧肟酸濃度的線性關(guān)系:Y=0.002 76+0.098 63X,相關(guān)系數(shù):R2=0.999 9,線性關(guān)系良好.通過(guò)公式計(jì)算可知該酶液的酶活為7.3 U/(mL·m in),粗酶粉酶活為3 650 U/(g·m in).

2.2 三因素五水平二次回歸正交組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件,進(jìn)行了20組實(shí)驗(yàn),得到相應(yīng)的凝膠強(qiáng)度數(shù)據(jù)(見(jiàn)表3).

保存16 h后觀察各組凝膠形成情況,發(fā)現(xiàn)未加酶的13號(hào)幾乎不能形成凝膠.呈流動(dòng)狀,其它的凝膠呈淡黃色且形成情況較好.

表3 二次回歸通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.3 Experimental plan and results of quadratic rotation-regression-combination design

2.3 MTG酶處理SPI凝膠強(qiáng)度SA S分析結(jié)果

2.3.1 SPI凝膠強(qiáng)度數(shù)學(xué)模型的建立

利用SA S軟件對(duì)結(jié)果分析,經(jīng)回歸擬合后,各試驗(yàn)因子對(duì)凝膠強(qiáng)度y的影響可用下列函數(shù)表示:

1.093 400X3·X2-0.762 508X3·X3,其中:X1,X2,X3分別為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度.

利用SA S軟件對(duì)結(jié)果運(yùn)行SA S-RSR程序?qū)?0個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,同時(shí)對(duì)回歸得到的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行顯著性分析(見(jiàn)表4).

表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表(回歸系數(shù))Tab.4 Analysis of variance to the test result of the gel of SPI(regression coefficient)

回歸方程的顯著性F檢驗(yàn)在0.01水平上不顯著,方程的決定系數(shù)R2=0.737 9,說(shuō)明試驗(yàn)所選因素對(duì)彈性有顯著影響.擬合度F檢驗(yàn):F=0.92,P=0.536 3,結(jié)果不顯著,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的回歸模型是適合的,擬合不足被否定.

2.3.2 對(duì)各因素顯著性的比較

由于各因素都對(duì)大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度值有貢獻(xiàn),比較各因素顯著性結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 影響大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度因素顯著性的比較結(jié)果Tab.5 Variance analysis of factors affected SPIwater holding capacity

分析結(jié)果表明,在所選水平范圍內(nèi),三因素對(duì)經(jīng)MTG作用的SPI的凝膠性的影響從大到小依次為加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度.

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出的酶最佳處理?xiàng)l件為50.961 841℃,反應(yīng)1.469 934 h,加酶量9.816 903 U/g時(shí)大豆分離蛋白凝膠有最大凝膠強(qiáng)度即74.946 339 g/mm2(見(jiàn)表6).

表6 SPI凝膠性在各因素下的優(yōu)化值和最優(yōu)條件下的最佳組合Tab.6 Best combination under the optim ization condition of the gel of SPI in each factor

2.4 MTG酶處理對(duì)SPI持水性SA S分析

利用SA S軟件對(duì)結(jié)果分析,經(jīng)回歸擬合后,各試驗(yàn)因子對(duì)持水性Y的影響可用下列函數(shù)表示:

0.000 0467 72X3·X3,其中:X1,X2,X3分別為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度.

根據(jù)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件(見(jiàn)表1),進(jìn)行了20組實(shí)驗(yàn),得到相應(yīng)的凝膠保水率數(shù)據(jù)(見(jiàn)表3),找到各因素對(duì)TGase參與保持水分反應(yīng)的相互影響,得到各因素之間的最佳組合.

利用SA S軟件的結(jié)果運(yùn)行SA S-RSR程序?qū)?0個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,同時(shí)對(duì)回歸得到的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行顯著性分析(見(jiàn)表7).

表7 MTG對(duì)大豆分離蛋白持水性試驗(yàn)結(jié)果方差分析(回歸系數(shù))Tab.7 Analysis of variance in the testedWHC SPI byMTG(regression coefficient)

回歸方程的顯著性F檢驗(yàn)在0.05水平上顯著,方程的決定系數(shù)R2=0.763 9,說(shuō)明試驗(yàn)所選因素對(duì)持水性有顯著影響.擬合度F檢驗(yàn):F=0.44,P=0.805 6,結(jié)果不顯著,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的回歸模型是適合的,擬合不足被否定.

由于各因素都對(duì)大豆分離蛋白的W HC值有貢獻(xiàn),比較各因素顯著性結(jié)果見(jiàn)表8.

表8 影響大豆分離蛋白持水性因素顯著性比較結(jié)果Tab.8 Variance analysis of factors affected SPI gel strength

分析結(jié)果表明,在所選水平范圍內(nèi),三因素對(duì)經(jīng)MTG作用的SPI持水性的影響從大到小依次為酶活量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間(見(jiàn)表9).

大豆分離蛋白凝膠持水性受酶作用條件的影響,當(dāng)49℃、反應(yīng)1.27 h、酶濃度為7.78U/g時(shí),SPI的持水率最高,達(dá)到96.47%.

表9 最佳組合條件下的大豆分離蛋白凝膠持水性Tab.9 WHC of SPI gel under the optimum combination

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)證明響應(yīng)面分析法能快速有效地從3種影響MTG對(duì)SPI凝膠形成的重要因素中實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化并得出優(yōu)化結(jié)果.研究表明:加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度均對(duì)SPI凝膠的形成具有重要影響.MTG酶在一定范圍內(nèi)有助于SPI凝膠的形成.在51℃、反應(yīng)1.5 h,酶濃度9.82 U/g時(shí)SPI有最大凝膠強(qiáng)度值74.95 g/mm2;在49℃,反應(yīng)1.3 h,酶濃度7.78 U/g時(shí)SPI的持水率為96.47%.

[1]孫 煥,張春紅,陳海英,等.復(fù)合改性提高大豆分離蛋白功能性的研究[J].生物技術(shù)通訊,2006,17(1):49-51.

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Effect of Microbial Transglutam inase on Gelation and Water Holding Capacity of Soy Protein Isolate

He Dong lan,Peng Baoyu,Zhang Ying,Ou′yang Linlan
(Key L aboratory for Microorganism and Biotransformation,South-CentralU niversity for Nationalities,Wuhan 430074,China)

Them icrobial transglutam inase(MTG)used for food processing was obtained from the fermentation solution ofStrep toverticilliumsp.CJ3033 by filtration,centrifugation,freeze-concentration,ethanol precipitation and freeze-dried.The effect forMTG on the gel formation characteristics and water holding capacity of soy protein isolate(SPI)were studied by physical analyzer.The MTG concentration added,acting time and processing temperature were tested on the SPI gel formation and water retention through the composite design of quadratic regression.The results showed thatMTGase could improve the SPI quality distinctly.The best SPI gel strength of 74.95 g/mm2was obtained at 51℃,processing time of 1.5 h and 9.82 U/g enzyme addition.The best water holding capacity ratio at 96.47%was obtained at the reaction temperate of 49℃for 1.3 h and enzyme concentration of about 7.78 U/g.

transglutam inase;soy protein isolate(SPI);gel strength;water holding capacity

Q 556

A

1672-4321(2010)01-0041-04

2010-01-14

何冬蘭(1964-),女,教授,研究方向:分子微生物學(xué)及酶學(xué),E-mail:ymhlh@yahoo.com.cn

湖北工業(yè)大學(xué)湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(301,21619);中南民族大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(XJS09002)