殼聚糖在苦參醇提工藝中的應(yīng)用

鞏曉宇,陳科力

(1湖北中醫(yī)學(xué)院省部共建中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430065,Ch ina;2深圳市龍崗人民醫(yī)院,深圳518172,Ch ina)

苦參為豆科植物苦參(Sophorae f lavescen tisA it)的干燥根,具有清熱燥濕,殺蟲(chóng)利尿等作用,苦參所含有效成分主要為苦參堿和氧化苦參堿等易溶于水的生物堿類成分.關(guān)于苦參總堿的提取精制方法,有大量報(bào)道及文獻(xiàn)比較了水提醇沉法、高速離心法和殼聚糖絮凝法對(duì)提取液中苦參總堿的精制過(guò)程[1-5],認(rèn)為殼聚糖絮凝法是一種較好的精制方法.但是,還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)殼聚糖精制苦參總堿的絮凝工藝條件進(jìn)行優(yōu)選的深入研究的報(bào)道.本文以苦參堿,氧化苦參堿含量為考察指標(biāo),對(duì)苦參醇提取液加入殼聚糖絮凝劑的最佳濃度、比例、靜置時(shí)間進(jìn)行選擇.

1 材料和儀器

苦參為豆科植物苦參的干燥根,購(gòu)于武昌區(qū)藥材公司,經(jīng)筆者鑒定.

戴安P680高效液相色譜儀,UVD 170UV檢測(cè)器,四元梯度泵,HKZJZ-830171BA F戴安變色龍高效液相數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)戴安公司).

苦參堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,批號(hào):110805-200306);氧化苦參堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,批號(hào):0780-200004)絮凝專用殼聚糖(上海偉康生物制品有限公司).

甲醇為色譜純(中國(guó)上海陸忠試劑廠);四氫呋喃(THF)為色譜純(美國(guó)TED IA 公司);重蒸餾水為自制;其他試劑均為分析純.

2 方法和結(jié)果

2.1 苦參醇提取液的制備

稱取苦參藥材200g,加入6倍量的60%乙醇,水浴回流提取3次,每次2 h,過(guò)濾,合并三次濾液,適當(dāng)濃縮并定容至一定體積.

2.2 苦參堿、氧化苦參堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil C8-3(5.0μm,250mm×4.6 mm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:甲醇:0.25%三乙胺的0.015m o l/L磷酸氫二鉀溶液(用25%磷酸調(diào)節(jié)pH=3)(5:95);流速:1.0m L/m in;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm.理論塔板數(shù)應(yīng)當(dāng)不低于5 000.

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取苦參堿對(duì)照品適量,加甲醇配制成濃度為52μg/m L的溶液;精密稱取氧化苦參堿對(duì)照品適量,加甲醇配制成濃度為146μg/m L的溶液,即得.

2.2.3 供試品溶液的制備和測(cè)定

精密吸取制備和定容后的苦參醇提取液50 m L,減壓濃縮至近干,轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中,真空干燥至恒重,即得干浸膏.取干浸膏粉末約0.01 g,移至10 m L量瓶中,加無(wú)水乙醇稀釋至刻度,過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得.測(cè)定時(shí),精密吸取供試品溶液20μL注入高效液相色譜儀,即得.

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.分別制備不同濃度的苦參堿對(duì)照品溶液,精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得回歸方程為:Y=23.178X+0.039 8,r=0.999 8.結(jié)果表明,苦參堿進(jìn)樣量在0.208～1.04μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

(2)氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備.分別制備不同濃度的氧化苦參堿對(duì)照品溶液,精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得回歸方程為:Y=40.649X-0.184 8,r=0.999 7.結(jié)果表明,氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.584～2.92μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

(1)苦參堿加樣回收率試驗(yàn).精密稱取6份已知苦參堿含量的苦參提取液的干浸膏粉約15m g于50m L量瓶中,分別精密加入適量苦參堿對(duì)照品,加甲醇至刻度,精密吸取供試品溶液20μL注入高效液相色譜儀,按上法測(cè)定含量,計(jì)算回收率.加樣回收率平均值為99.8%,RSD為0.90%.

(2)氧化苦參堿加樣回收率試驗(yàn).精密稱取6份已知氧化苦參堿含量的苦參提取液的干浸膏粉約5m g于50m L量瓶中,分別精密加入適量氧化苦參堿對(duì)照品,加甲醇至刻度,精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀,按上法測(cè)定含量,計(jì)算回收率.加樣回收率平均值為101.2%,RSD為1.46%.

3 殼聚糖澄清工藝的考察

3.1 殼聚糖溶液的配制

分別取0.1 g,0.25 g,0.5 g,0.75 g,1.0 g殼聚糖粉末,加入50m L的1%的醋酸溶液放置溶脹24 h,再用1%的醋酸溶液定容為100m L,混勻,即得0.1%,0.25%,0.5%,0.75%,1.0%的殼聚糖醋酸溶液.

3.2 苦參藥液濃縮比例的考察

制備3份苦參醇提取液,分別濃縮至藥材-濃縮液為1∶4,1∶6和1∶8,放冷至室溫,分別于攪拌下加入新鮮配制的0.25%的殼聚糖溶液,至溶液中有絮狀沉淀產(chǎn)生,靜置12 h,濾過(guò).濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定苦參堿和苦參總堿含量.結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 苦參藥液濃縮比例的考察Tab.1 Inspecting o f p ropo rtion o f concen trated so lu tion vo lum e

結(jié)果濃縮比為1∶4時(shí),經(jīng)澄清后苦參堿的轉(zhuǎn)移率很低;濃縮至1∶6和1∶8的殼聚糖澄清效果差別不大,但是1∶8的濃縮液耗用殼聚糖溶液的量較大,故選擇藥液濃縮比例為1∶6.

3.3 殼聚糖溶液濃度的考察

制備5份苦參醇提取液,分別濃縮至藥材與濃縮液比為1∶6,分別于室溫?cái)嚢柘录尤肱浜玫?.1%,0.25%,0.5%,0.75%,1.0%的殼聚糖溶液,至溶液中有絮狀沉淀產(chǎn)生,靜置24 h,濾過(guò),觀察澄清過(guò)程.過(guò)濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定苦參堿和苦參總堿含量.結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 殼聚糖溶液濃度的考察Tab.2 Testof ch itosan concen tration

結(jié)果:殼聚糖的加入量,一般在0.1%～1%左右,據(jù)澄清后含量測(cè)定結(jié)果,選用0.75%的殼聚糖溶液進(jìn)行澄清.

3.4 殼聚糖靜置時(shí)間的考察

制備3份苦參醇提取液,分別濃縮至藥材與濃縮液比為1∶6,于室溫?cái)嚢柘录尤肱浜玫?.75%殼聚糖溶液,分別靜置12h,18h,24h,濾過(guò),觀察澄清過(guò)程.過(guò)濾液按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定苦參堿和苦參總堿含量.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 殼聚糖靜置時(shí)間的考察Tab.3 Inspecting of tim e fo r ch itosan standing

結(jié)果表明,殼聚糖靜置時(shí)間12 h,藥液基本澄清,但含量較靜置18 h,24 h的低,說(shuō)明靜置時(shí)間不足,而靜置18 h的與靜置24 h的樣品含量無(wú)顯著差別,所以選靜置18 h.

4 結(jié)果與討論

在以前的研究中,通過(guò)比較我們已經(jīng)優(yōu)選出苦參中苦參堿的最佳醇提取工藝為:加藥材6倍量的60%乙醇,回流提取3次,每次2 h.因此本文苦參醇提物的制備也采用此方法.

優(yōu)選殼聚糖澄清工藝為:濃縮至生藥質(zhì)量-濃縮液體積為1∶6,攪拌下加入0.75%的殼聚糖醋酸溶液,靜置18 h,濾過(guò).實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),殼聚糖醋酸溶液放置的時(shí)間越長(zhǎng),絮凝后的提取液中苦參總堿含量越低,所以澄清時(shí)應(yīng)使用新鮮配制的殼聚糖溶液.

[1] 宋浩亮,羅華菲.殼聚糖對(duì)平胃膠囊中苦參堿含量影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].西北藥學(xué)雜志,2002,17(2):59-60.

[2] 張保獻(xiàn),馮青然.不同精制方法對(duì)苦參水提取液中苦參總生物堿含量的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(10):607-609.

[3] 陳科力,陳 剛.中藥中的天然環(huán)氧化酶和酯氧化酶抑制劑及其作用.中南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,28(1):42-47.

[4] 張 形,徐蓮英.殼聚糖用于部分單味中藥浸提液澄清效果的研究[J].中草藥,1999,30(10):745-747.

[5] 蔣珍藕.苦參堿的提取工藝及測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11(8):90-94.