紙片法快速檢測(cè)生活飲用水總大腸菌群的探討

魏海明，張中偉

(西安鐵路疾病預(yù)防控制所，陜西 西安 710054)

大腸菌群的測(cè)定是評(píng)價(jià)生活飲用水衛(wèi)生狀況的一項(xiàng)重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)。目前我們對(duì)水中總大腸菌群的檢驗(yàn)，一般采用多管發(fā)酵法［1］。此方法操作步驟繁瑣，耗時(shí)長，需配制大量培養(yǎng)基并要進(jìn)行大量洗刷、滅菌等工作，難以滿足大批量樣品以及突發(fā)事件時(shí)快速檢測(cè)的需要。1956年，F(xiàn)org等人［2］提出了檢測(cè)大腸菌群的快速紙片法，在餐具消毒等的定性檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用［3］，該法目前已列入了我國衛(wèi)生部《生活飲用水檢驗(yàn)規(guī)范》(2001)，國家環(huán)?？偩帧端蛷U水監(jiān)測(cè)分析方法》(第4版)也將該法列為 C類方法［4］。本文在用紙片法檢測(cè)生活飲用水中的大腸菌群時(shí)，同步采用多管發(fā)酵法進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)以探討用紙片法快速檢測(cè)生活飲用水中總大腸菌群的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸菌群快速檢測(cè)紙片(南京三愛寶業(yè)生產(chǎn)，國家衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所監(jiān)制);紙片規(guī)格:大紙片為10 cm×10 cm，小紙片為5 cm× 5 cm。乳糖膽鹽發(fā)酵液、乳糖復(fù)發(fā)酵液、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)和革蘭氏染液均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 方法和步驟

1.2.1 樣品來源:西安鐵路局生活飲用水水源。

1.2.2 水樣采集:用采水器或其他滅菌器采集水樣500 mL放入滅菌瓶內(nèi)。

1.2.3 多管發(fā)酵法:按照 GB/T 5750.12—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》中的多管發(fā)酵法操作。

1.2.4 紙片法

1.2.4.1 原理:大腸菌群的細(xì)菌都是發(fā)酵乳糖的，紙片法是將一定量的乳糖、指示劑(溴甲酚紫和TTC)以及營養(yǎng)成分等吸附于一定面積的無菌濾紙上，當(dāng)細(xì)菌生長繁殖時(shí)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使pH值降低，溴甲酚紫指示劑由藍(lán)色變黃色，此時(shí)產(chǎn)酸后的檢樣在紙片上呈現(xiàn)出黃色反應(yīng)，同時(shí)大腸菌群含有的脫氫酶在適宜的pH值范圍內(nèi)，還原TTC形成紅色的不溶性三苯甲替(紅四氮唑)，可在產(chǎn)酸后的黃色背景前提下顯示出紅色斑點(diǎn)(或紅暈)。

1.2.4.2 操作步驟:調(diào)節(jié)水樣pH值至中性(7.0～8.0)每份監(jiān)測(cè)水樣按多管發(fā)酵法濃度梯度稀釋，接種水樣總量為55.5 mL，分別接種大紙片五張，小紙片10張。每張大紙片接種10 mL水樣，5張小紙片每張接種1 mL，另5張小紙片每張接種1∶10稀釋(用無菌生理鹽水稀釋)的水樣 1 mL。接種水樣均勻涂布于紙片上，用手輕輕壓平，作好標(biāo)記放入鋪有濕紗布的搪瓷盤中，置于恒溫箱內(nèi)，于 (37±1)℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4.3 結(jié)果判斷與報(bào)告:若紙片保持紫藍(lán)色不變?yōu)榇竽c菌群陰性，紙片變黃并在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈為陽性［5］。根據(jù)每份水樣紙片的陽性張數(shù)，查多管發(fā)酵法的總大腸菌群MPN檢索表，查出相應(yīng)的MPN值。

2 結(jié)果

186份水樣同時(shí)用兩種方法進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)，紙片法大腸菌群檢測(cè)陽性數(shù)為24份，陰性數(shù)為162份，陽性率12.90%;發(fā)酵法大腸菌群檢測(cè)陽性數(shù)為 27份，陰性數(shù)為 159份，陽性率14.52%。兩者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(χ2= 0.135，P>0.05)。兩種方法檢測(cè)大腸菌群的MPN值見表1。

表1 兩種方法檢測(cè)大腸菌群比較

由表1可見，186份水樣中180份水樣兩種檢測(cè)方法MPN值完全相同，其符合率為96.77% (180/186)。對(duì)陽性樣品的 MPN值進(jìn)行比較，結(jié)果兩者相同的有21份，分別占紙片法陽性率87.5%(21/24)和發(fā)酵法陽性率的 77.78% (21/27)。不同的陽性樣品MPN值基本相近。

3 討論

兩種方法檢測(cè)大腸菌群陽性率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異。此結(jié)果說明紙片法檢測(cè)大腸菌群所得結(jié)果與發(fā)酵法基本一致，但紙片法測(cè)定周期比多管發(fā)酵法縮短了2 d左右，僅需24 h。

相對(duì)于多管發(fā)酵法，紙片法更加省時(shí)、省力，簡便易行，適用于進(jìn)行大批量樣品快速檢測(cè)，特別是突發(fā)事件中水樣檢驗(yàn)的初步篩查工作。從而使檢測(cè)單位在工作中節(jié)省大量的人力、物力，并且在遇到突發(fā)事件時(shí)能快速展開工作初步篩查大量典型的陽性菌落，為盡快處理突發(fā)事件爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。

檢驗(yàn)中有2份水樣，其10 mL接種量的4張紙片均變黃色而無紅色斑點(diǎn)和紅暈，按GB14934—94［5］應(yīng)判為陰性，但將此兩份水樣進(jìn)行多管發(fā)酵確證試驗(yàn)后確認(rèn)為大腸菌群陽性，且水樣污染較嚴(yán)重(大腸菌群分別是350 MPN/100 mL和540 MPN/100 mL)。這是因?yàn)楫?dāng)水樣中大腸菌群較多時(shí)，大腸菌群將大量的乳糖分解后產(chǎn)酸使紙片變黃色，同時(shí)使得脫氫酶的活性受到抑制，無法還原TTC，而不能形成紅色斑點(diǎn)或紅暈，此時(shí)的結(jié)果是紙片變黃。因此，檢測(cè)中如果在接種高稀釋度水樣的紙片時(shí)呈陽性結(jié)果，接種低稀釋度水樣(或原水樣)紙片出現(xiàn)黃色而無紅色斑點(diǎn)和紅暈時(shí)，此種情況也應(yīng)判為陽性。

［1］ GB/T 5750.12—2006，生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)［S］.

［2］ 魏云早.大腸菌群紙片與GB法檢測(cè)消毒餐具方法的調(diào)查研究［J］.安徽預(yù)防科學(xué)，2001，2(2):29.

［3］ 余陽，龐秀蓮，韋炳生.紙片法與培養(yǎng)發(fā)酵法檢測(cè)茶具大腸菌群污染結(jié)果的比較［J］.中國消毒學(xué)雜志，2006，13(4): 237－238.

［4］ 國家環(huán)境保護(hù)總局水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］.第4版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

［5］ GB14934—94，食(飲)具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.