雌激素對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦組織傷區(qū) Bcl-2和 Bax表達(dá)的影響

霍龍偉 張建生 王小強(qiáng) 楊文征 姚焱鵬

雌激素對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦組織傷區(qū) Bcl-2和 Bax表達(dá)的影響

霍龍偉 張建生 王小強(qiáng) 楊文征 姚焱鵬

目的 探討雌激素是否通過(guò)影響大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦組織傷區(qū) Bcl-2和 Bax表達(dá),起到腦保護(hù)作用。方法 采用改良的 Feeney自由落體腦損傷模型,將 60只 Wistar健康雄性大鼠隨機(jī)分為治療組、對(duì)照組和外傷組,治療組的大鼠用苯甲酸雌二醇治療。應(yīng)用 HE染色檢測(cè)腦組織和應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)傷區(qū)腦組織 Bcl-2及 Bax的表達(dá)變化,并且計(jì)算出 Bcl-2和 Bax表達(dá)的比值。結(jié)果 治療組Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組和創(chuàng)傷組(P＜0.05),創(chuàng)傷組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。三組的 Bax表達(dá)相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療組 Bcl-2和 Bax表達(dá)的比值高于對(duì)照組和外傷組。結(jié)論 雌激素可能是通過(guò)促進(jìn) Bcl-2表達(dá)來(lái)減少顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用。

顱腦創(chuàng)傷;雌激素;Bcl-2;Bax

越來(lái)越多的證據(jù)表明,性別差異對(duì)腦損傷預(yù)后有明顯影響,并認(rèn)為雌激素可能具有腦保護(hù)作用[1,2]。但是有關(guān)雌激素對(duì)腦保護(hù)研究主要在缺血性腦病方面,而與顱腦創(chuàng)傷(TBI)關(guān)系及其發(fā)生機(jī)制少有研究。本研究旨在通過(guò)研究大鼠 TBI后,雌激素是否影響傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞 Bcl-2和Bax表達(dá),從而了解雌激素對(duì) TBI的保護(hù)作用,為防治 TBI提供新的希望。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康雄性Wistar大鼠 60只,體質(zhì)量 265～310g(由甘肅省中醫(yī)學(xué)院 SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,并在其內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。隨機(jī)分為治療組、對(duì)照組、外傷組,每組 20只大鼠。根據(jù)傷后處死時(shí)間點(diǎn)不同,將每組大鼠再分為 12、24、48、72h組,共 5個(gè)亞組,各個(gè)亞組動(dòng)物 5只。治療組:用改良 Feeney自由落體腦損傷裝置致傷動(dòng)物,并給予苯甲酸雌二醇(1mg/kg·d)腹腔注射治療,于傷后立即治療 1次,以后每天治療 1次,直至動(dòng)物處死;對(duì)照組:同法致傷動(dòng)物,并給予等量生理鹽水腹腔注射治療;外傷組:同法致傷動(dòng)物不予治療。

1.2 試劑及儀器 苯甲酸雌二醇由廣州白云山明興制藥有限公司提供;Bcl-2和 Bax試劑盒由美國(guó) Bioworld Technology Inc公司提供;DAB顯色盒和鼠抗兔 IG由博士德公司提供;顯微鏡 CX 31來(lái)源于 Olympus公司;顯微處理系統(tǒng)來(lái)源山東易創(chuàng);BZ-2000圖像分析系統(tǒng)來(lái)源于成都泰盟。

1.3 模型制備 所有動(dòng)物用 10%水合氯醛 350mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠,剪去大鼠頭部毛發(fā)俯臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,消毒,沿中線切開頭皮約 2.0 cm,暴露頂部,于右側(cè)中線旁 2 mm、冠狀縫后 4mm處,牙科鉆鉆一直徑約 5 mm骨窗,保持硬腦膜完整,按改良的Feeney法(擊錘重 20 g,底面直徑約 4 mm,30 cm高處自由落體)致大鼠右頂葉腦創(chuàng)傷模型,骨蠟封閉,縫合頭皮后自由喂養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案取不同的時(shí)間點(diǎn)的大鼠,經(jīng)麻醉、開胸、經(jīng)左心室插管、剪開右心耳、用生理鹽水沖洗直至清亮、用 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定 60min后,取出大腦置于 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定 24 h后,在腦組織損傷區(qū)做冠狀切面,常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.5 HE染色和Bcl-2和 Bax免疫組織化學(xué)方法 取各組石蠟切片行常規(guī) HE染色和嚴(yán)格按照SP法行免疫組織化學(xué),先進(jìn)行脫蠟、水化、PBS洗 3次、抗原修復(fù)、PBS洗 3次、加封閉液、加Ⅰ抗、4℃過(guò)夜、PBS洗 3次、加Ⅱ抗、PBS洗 3次、DAB顯色、蘇木精復(fù)染 2m in、鹽酸酒精分化、DAB溶液顯色、自來(lái)水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。

1.6 結(jié)果觀察 光鏡下觀察 HE切片和應(yīng)用軟件圖像分析系統(tǒng),在 400倍鏡下計(jì)數(shù) Bcl-2和Bax的陽(yáng)性細(xì)胞率。計(jì)數(shù)方法:每張切片取8個(gè)高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比,再取這 8個(gè)高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比平均值代表該張切片陽(yáng)性細(xì)胞率,同法記數(shù)各時(shí)間點(diǎn)切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),總平均數(shù)代表該時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性細(xì)胞率,均以百分比表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)中所得 Bcl-2和Bax數(shù)據(jù)用±s表示,用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行成組設(shè)計(jì) t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè) α=0.05。Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率與 Bax陽(yáng)性細(xì)胞率均數(shù)比值是通過(guò)均數(shù)比值計(jì)算公式得出。

2 結(jié)果

2.1 HE染色后在光鏡下觀察到 治療組中神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰,未見明顯的神經(jīng)細(xì)胞核固縮、核碎裂、核染色質(zhì)邊集現(xiàn)象,排列分布均勻(圖 1);對(duì)照組和外傷組中可見局灶性壞死,少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹,胞漿周圍出現(xiàn)空暈,排列較松散,并伴有明顯的神經(jīng)細(xì)胞核固縮、核碎裂,凋亡細(xì)胞皺縮,胞漿嗜酸性增強(qiáng),胞質(zhì)致密,核染色質(zhì)邊集(圖 2)。

2.2 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要位于損傷鄰近區(qū)(圖 3),遠(yuǎn)離損傷區(qū)可見少量陽(yáng)性細(xì)胞(圖4);Bc1-2陽(yáng)性細(xì)胞染色位于細(xì)胞漿和(或)核周,為棕黃色;治療組 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞百分比在傷后24 h達(dá)到高峰,隨后逐漸下降;外傷組和對(duì)照組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞百分比在傷后 48 h達(dá)到高峰,隨后逐漸下降;治療組與外傷組、對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比,Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而外傷組和對(duì)照組之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 1)。

2.3 Bax陽(yáng)性細(xì)胞同樣為細(xì)胞漿著色位于細(xì)胞漿和(或)核周,為棕黃色,位于損傷鄰近區(qū)(圖 5);遠(yuǎn)離損傷區(qū)可見少量陽(yáng)性細(xì)胞(圖 6),各組Bax陽(yáng)性細(xì)胞在傷后早 24h達(dá)到高峰,隨后逐漸下降;各組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞百分比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相互比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 2)。

2.4 三組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率與Bax陽(yáng)性細(xì)胞率均數(shù)比值在同時(shí)間點(diǎn)相比較,治療組的比值是最高的,并且在 24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)比值超過(guò) 1.0,而對(duì)照組、外傷組均數(shù)比值最高值都沒有超過(guò) 1.0(表 3)。

表 1 大鼠腦創(chuàng)傷后Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率變化(±s,%,n=5)

表 1 大鼠腦創(chuàng)傷后Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率變化(±s,%,n=5)

注:a治療組分別與對(duì)照組和外傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);b對(duì)照組與外傷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

組別 12 h 24 h 48 h 72 h治療組 24.94±0.78a 40.76±0.34a 38.71±0.25a 36.26±0.68a對(duì)照組 20.53±0.96b 25.23±0.19 b 34.42±0.54b 28.23±0.14b外傷組 20.79±0.52 24.98±0.43 33.86±0.87 28.12±0.23

表 2 大鼠腦創(chuàng)傷后Bax陽(yáng)性細(xì)胞率變化(±s,%,n=5)

表 2 大鼠腦創(chuàng)傷后Bax陽(yáng)性細(xì)胞率變化(±s,%,n=5)

注:a治療組分別與對(duì)照組和外傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);b對(duì)照組與外傷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

組別 12 h 24 h 48 h 72 h治療組 26.47±0.11a 39.61±0.50a 37.41±0.86a 32.67±0.56a對(duì)照組 27.43±0.87b 40.44±0.75b 37.86±0.62b 32.23±0.29b外傷組 26.99±0.62 39.54±0.91 38.21±0.33 32.43±0.81

表 3 大鼠腦創(chuàng)傷后Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率與Bax陽(yáng)性細(xì)胞率均數(shù)比值變化

3 討論

隨著對(duì)腦損傷深入研究和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)腦損傷后細(xì)胞凋亡對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有著重要的影響[3]。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制中,Bax和Bcl-2是影響細(xì)胞凋亡重要因素之一。Bax表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,它主要通過(guò)自身兩個(gè) Bax形成同源二聚體并表達(dá)蛋白,其表達(dá)蛋白通過(guò)介導(dǎo)線粒體膜細(xì)胞色素 C得以穿過(guò)線粒體膜,并進(jìn)一步激活caspase-9以及caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。Bcl-2表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡,它主要通過(guò)和Bax競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,形成更為穩(wěn)定的異源二聚體,從而減少Bax形成同源二聚體,抑制Bax蛋白表達(dá)起抗凋亡作用[5]。因此Bcl-2/Bax比例也是決定細(xì)胞是否凋亡重要因素之一。正常情況下 Bcl-2/Bax比例保持著動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)在病理情況下,比值下降時(shí),細(xì)胞就開始凋亡[6]。

雌激素是由雌激素合成酶催化雄激素轉(zhuǎn)化而來(lái)的,其生理活性最強(qiáng)的是雌二醇。腦作為雌激素重要的靶器官之一,腦內(nèi)很多核團(tuán)能產(chǎn)生雌激素合成酶并表達(dá)雌激素受體,因此雌激素對(duì)腦的發(fā)育與腦功能發(fā)揮起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究表明治療組即雌激素組的 Bcl-2表達(dá)在傷后 24 h達(dá)高峰,48h和 72h逐漸下降。外傷組和對(duì)照組Bcl-2表達(dá)在傷后逐漸增高于 48h達(dá)高峰以后逐漸下降,并且高峰值低于同時(shí)間點(diǎn)治療組峰值,而且下降速度快于治療組。因此從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠TBI后,雌激素可以上調(diào)抑制凋亡因子Bcl-2表達(dá),這與國(guó)內(nèi)外的一些研究結(jié)果相類似[8,9]。有學(xué)者研究認(rèn)為雌激素可能通過(guò)激活 PI3-K-AKT信號(hào)途徑激活,再激活第二信使環(huán)腺苷酸-蛋白激酶 A-環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白途徑,進(jìn)而上調(diào) Bcl-2表達(dá)[10]。Bax表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)高峰發(fā)生在 24h,以后逐漸下降,并且治療組、對(duì)照組和外傷組相互比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明雌激素對(duì)Bax表達(dá)可能不具有影響。但從各組 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率與Bax陽(yáng)性細(xì)胞率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均數(shù)比值分析可以進(jìn)一步表明雌激素抑制凋亡是通過(guò)提高 Bcl-2表達(dá),進(jìn)而提高 Bcl-2/Bax比值,減少 Bax形成同源二聚體,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而減輕TBI對(duì)腦功能的損害。

本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠顱腦創(chuàng)傷后,Bcl-2和Bax高表達(dá)發(fā)生在損傷鄰近區(qū)而不是在損傷區(qū)和遠(yuǎn)離損傷區(qū)。這可能損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)壞死而無(wú)表達(dá)能力,遠(yuǎn)離損傷區(qū)低表達(dá)可能與該區(qū)受損程度輕有關(guān)。通過(guò) HE染色觀察發(fā)現(xiàn),治療組與對(duì)照組、外傷組相比較,神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯減輕,這從另一方面提示雌激素可能通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷,發(fā)揮腦保護(hù)作用。

總之,雌激素對(duì)TBI后腦保護(hù)機(jī)制非常復(fù)雜,并且有諸多爭(zhēng)議[11]。本研究結(jié)果顯示,雌激素可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,但是有關(guān)雌激素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制還是有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of estrogen on the expressions of Bcl-2 and Bax genes of impaired brain tissue after traumatic head injury in rats

HUOLong-wei,ZHANG Jian-sheng,REN Hai-jun,etal.The Second Hospitalof Lanzhou University,Lanzhou730030,China

Objective To investigatewhether estrogen do have the brain protective function,by regulated the expression of Bcl-2 and Baxon the impaired brain tissueof ratswith traumatic head injury(TBI).Methods TBImodel was established according to Feeney'smethod.Sixtymale rats were divided into 3 groups,i.e.treatment group,controlgroup and wound group.Themale ratswere treatmentby injection ofestrogen in the treatment group.The brain tissuewas determined by Hematoxylin and eosin(HE)staining and image analysis.Expressionsof Bcl-2 and Bax in the brain tissuewere determined respectively by immunohistochemical technique in all the rats and Bcl-2 and Bax expression's ratio is calculated.Results The expression of Bcl-2 was significantly higher in the treatmentgroup than the control group and the wound group(P＜0.05).Therewas no significant difference between the expression of Bcl-2 in the controlgroup and thatof Bcl-2 in thewound group(P＞0.05).Therewere no significant differences in the expression of Bax among the three groups at every stage(P＞0.05).The expression's ratio of the treatment group's Bcl-2 and Bax is higher than that of the control group and thatof the wound group.Conclusion Estrogen can reduce theneuralapoptosis of impaired brain tissue after TBI in rats through promoting the expression of Bcl-2.

Traumatic head injury;Estrogen;Bcl-2;Bax

730030蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科

·臨床案例·