粟米草中抗腫瘤的活性成分研究

劉可越， 劉海軍， 吳家忠， 高春華， 劉建云， 李雪芹， 周 斌

(1.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西省高等學(xué)校系統(tǒng)生物學(xué)臨床應(yīng)用重點實驗室，江西 九江332000;2.江西科技師范學(xué)院，江西南昌330000)

粟米草是番杏科植物Mullugo pentaphylla L.，為東南亞國家的傳統(tǒng)草藥，具有清熱解毒、抗菌利濕的功效，主治腹痛泄瀉、瘡癤腫毒、風(fēng)疹等癥［1］。我國粟米草藥用資源豐富，主要分布于江西省及華南大部分地區(qū)，以全草入藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，粟米草具有抗癌、殺精、抗心律失常、降壓等藥理作用［2-5］。埃及科學(xué)家曾報道粟米草根中具有能顯著抗癌的化學(xué)成分，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性 IC50僅為0.018 μmol/L。而粟米草在民間常作為治療瘡癰腫毒，“癰癥”即包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤疾病，因此用粟米草治療腫瘤有一定開發(fā)價值。然而近年來并未見其抗腫瘤方面的相關(guān)報道，因此為了探討其抗腫瘤的活性，充分利用豐富的藥源，筆者對粟米草的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)和瓊脂糖凝膠電泳法研究化合物體外對Hela腫瘤細(xì)胞增殖的影響。以期為粟米草抗腫瘤作用及其機理的深入研究和探索中藥粟米草在腫瘤治療應(yīng)用方面的前景提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

粟米草藥材采自江西省九江市廬山周邊，經(jīng)鑒定為粟米草屬(Mullugo)植物粟米草(Mullugo pentaphylla L.)，標(biāo)本保存于九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院廬山特色藥用植物研究所。熔點用X-4顯微熔點測定儀測定，溫度計未校正;質(zhì)譜用Thermo Finnigan LCQ advantage型質(zhì)譜儀測定;核磁共振氫譜、碳譜用Bruker AV-400核磁共振儀測定;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);層析用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，Sephadex LH-20柱層析填料購于Pharmacia公司。所用試劑均為分析純。紫杉醇為北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品，RPM11640和胰蛋自酶購自美國GIBCO公司，SDS為美國Biotec公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡(德國Leica公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)。腫瘤細(xì)胞株:人子宮頸癌細(xì)胞株Hela(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所)。

1.2 提取與分離

粟米草干燥全草3 kg，切成1～2 cm小段，用10倍量80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物浸膏90.5 g。該醇提物懸浮于水中，以石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，回收有機溶劑，得各部位萃取物。取石油醚部位萃取物15 g，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(20∶1→1∶1)梯度洗脫，得9個組分(Fr.P1-9)。其中Fr.P3(3.0 g)，F(xiàn)r.P4(2.3 g)和Fr.P9(3.6 g)分別經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(15∶1→2 ∶1)洗脫，得化合物1(22 mg)、2(10 mg)、3(25 mg)。取乙酸乙酯部位萃取物26 g，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(5∶1→0∶1)梯度洗脫，得8個組分(Fr.E1-8)。Fr.E1組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇洗脫，得化合物4(15 mg)。Fr.E8組分經(jīng)減壓回收溶劑分別出現(xiàn)顆粒狀沉淀，經(jīng)PHPLC純化的化合物5(12 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色片狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯5∶1)，mp 288～289℃，與表木栓醇對照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)∶16.38(C-1)，35.31(C-2)，72.53(C-3)，49.38(C-4)，37.64(C-5)，41.74(C-6)，17.23(C-7)，53.39(C-8)，37.12(C-9)，61.58(C-10)，35.43(C-11)，30.26(C-12)，38.67(C-13)，39.56(C-14)，32.63(C-15)，36.02(C-16)，30.05(C-17)，42.55(C-18)，35.65(C-19)，28.34(C-20)，32.88(C-21)，39.62(C-22)，11.60(C-23)，15.59(C-24)，18.12(C-25)，18.60(C-26)，20.10(C-27)，32.06(C-28)，34.99(C-29)，31.78(C-30)。其熔點、色譜行為及13C-NMR(CDCl3)資料均與文獻(xiàn)報道［6］一致，結(jié)果該化合物鑒定為表木栓醇。

化合物2:白色顆粒狀結(jié)晶(石油醚)，mp 82～84℃。紅外光譜顯示其為長鏈脂肪醇特征譜峰。EI-MS m/z∶453［M+1］+，421，153，125，97，83，71，57，43。質(zhì)譜顯示直鏈脂肪醇特征裂解，確定該化合物為三十一烷醇。

化合物3:白色針晶(乙酸乙酯)，mp 140～141℃，硫酸顯色呈綠色。與β-谷甾醇對照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致，1H-NMR(CDCl3)與13C-NMR(CDCl3)資料與文獻(xiàn)報道［7］一致，確認(rèn)其為 β-谷甾醇。

化合物4:黃色粉末(氯仿-甲醇)，mp 258～259℃，EIMS m/z 433［M+1］+。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ ∶8.01(2H，d，J=8.6 Hz，H=2′，6′)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，H=3′，5′)，6.76(1H，s，H-6)，6.25(1H，s，H-3)，4.65(1H，d，J=9.9 Hz，Glc H-1).13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.91(C-2)，101.86(C-3)，181.93(C-4)，158.92(C-5)，98.32(C-6)，162.28(C-7)，103.92(C-8)，160.81(C-9)，104.56(C-10)，121.68(C-1′)，128.90(C-2′，6′)，116.12(C-3′，5′)，161.63(C-4′)，Glu 信號 C-1″～C-6″:79.32，73.56，71.27，70.53，81.65，61.56. 以上波譜資料與文獻(xiàn)［8］中牡荊素報道一致，確認(rèn)其為牡荊素。

化合物5:淡黃色針晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 316～317℃，Mg-HCl反應(yīng)陽性，與槲皮素對照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致，ESI-MS m/z(%)∶303［M+1］+。13C-NMR(DMSO-d6)δ:146.90(C-2)，122.09(C-3)，176.16(C-4)，156.17(C-5)，93.56(C-6)，164.32(C-7)，98.32(C-8)，160.95(C-9)，103.21(C-10)，135.93(C-1′)，115.84(C-2′)，147.89(C-3′)，145.24(C-4′)，115.39(C-5′)，120.26(C-6′)。13C-NMR(DMSO-d6)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報道［9］一致，化合物鑒定為槲皮素。

3 化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的體外抑制作用

3.1 腫瘤細(xì)胞抑制率的測定

人宮頸癌Hela細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)含青、鏈霉素各100 U/mL，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d傳代一次。樣品以DMSO溶解，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，DMSO稀釋后最終濃度小于0.05%。將HeLa等腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50 μL(含1×104個細(xì)胞)，分別加入空白對照磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照(二甲基亞砜)、陽性對照(紫杉醇)以及不同濃度單體化合物(10、50、80、100、150、200、300、500 μg/mL)，每組均設(shè)3個復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入反應(yīng)停止液150 μL，靜置1 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度(OD)值，測定波長λ=570 nm，并計算腫瘤細(xì)胞抑制率。增殖抑制率(%)=(1-含藥孔OD平均值/對照孔OD平均值)×100%。

3.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析［10］

將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，3個皿內(nèi)加入化合物5，同時做空白對照，分別于12 h、24 h、48 h后取出。收集細(xì)胞，以PBS洗3次，加Tris飽和酚沉淀蛋白，加酚離心抽提，取上清液，加入冷無水乙醇，析出DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果并拍照。

4 實驗結(jié)果

4.1 對腫瘤細(xì)胞的增殖的影響

結(jié)果表明:化合物1、4、5對宮頸癌細(xì)胞Hela均顯示出一定的抑制作用，其中化合物4、5抑瘤作用較顯著。見表1。

表1 化合物抗腫瘤活性篩選結(jié)果

4.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

結(jié)果顯示:Hela細(xì)胞在化合物5的作用下，分別處理24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞凋亡時基因組DNA被特異性核酸內(nèi)切酶水解成小分子片段，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的梯狀條帶;而對照組Hela細(xì)胞DNA完整，具體見圖1。

5 討論

5.1 宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤之一，世界每年新發(fā)病例約50萬，我國發(fā)病率和病死率約占世界的1/3［11］。宮頸癌治療手段通常包括手術(shù)、化療及放療。但化療藥物的毒副作用及對機體的損害制約了其臨床應(yīng)用。而中藥中存在著毒副作用小的天然生物活性物質(zhì)，具有廣闊的開發(fā)前景。實驗證明粟米草中含有的化合物可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖作用，從活性的角度說明粟米草抗癌方面具有進(jìn)一步開發(fā)價值，為應(yīng)用粟米草治療癌癥提供了理論依據(jù)。

圖1 化合物5處理后的Hela細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳現(xiàn)象

5.2 惡性腫瘤的發(fā)生是多基因突變的細(xì)胞失控性生長，細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是其發(fā)生、發(fā)展的主要原因［12］，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的新方法之一［13］。本研究表明槲皮素素可體外誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡呈時間依賴關(guān)系。DNA凝膠電泳確證槲皮素作用Hela細(xì)胞72h出現(xiàn)典型“梯形”DNA條帶。上述結(jié)果提示槲皮素可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有效抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長。需要分離粟米草中更多的化學(xué)成分，研究其體外及體內(nèi)的抗腫瘤活性，為將粟米草開發(fā)成新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。

5.3 牡荊素和槲皮素化合物結(jié)構(gòu)母核均為黃酮體，差異是取代基位置不同，并且牡荊素為碳苷，槲皮素為氧苷。牡荊素和槲皮素的抗癌作用已有不少報道［14-16］。筆者前文報道過黃酮苷與苷元抗腫瘤的構(gòu)效關(guān)系，初步總結(jié)母核相同的黃酮氧苷一般較苷元抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用弱。黃酮碳苷和氧苷抗癌作用與其結(jié)構(gòu)有何關(guān)系是值得進(jìn)一步探討的問題。

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