不同工藝純化參芪扶正方中有效成分研究

袁旭江， 袁夢(mèng)泓， 張來華， 朱盛山

(廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006)

參芪扶正注射液是由黨參和黃芪組成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣扶正作用，臨床用于氣虛證肺癌、胃癌的輔助治療，與化療合用有助于提高療效、保護(hù)血象，提高氣虛患者免疫功能、改善氣虛癥狀及生存質(zhì)量［1-3］。該方主要有效成分有黃酮類、皂苷類、多糖等［4］，其中多糖含量最高。目前對(duì)黨參、黃芪提取純化研究多集中在皂苷類和多糖類成分方面［5，6］，而黃酮類等具發(fā)色團(tuán)的其他成分研究評(píng)價(jià)方面報(bào)道較為鮮見，在HPLC/UV/ELSD指紋圖譜聯(lián)合評(píng)價(jià)方面也鮮見。中藥及其復(fù)方提取純化技術(shù)和評(píng)價(jià)方法是中藥制劑現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)，一直受到關(guān)注和重視，因此，筆者以參芪扶正方為研究對(duì)象，采用大孔樹脂法、水提醇沉法、聚酰胺法等［7-9］多種純化工藝對(duì)參芪水煎液中除多糖外的其他成分進(jìn)行純化研究，運(yùn)用高效液相紫外吸收色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射圖譜進(jìn)行指紋圖譜技術(shù)分析，結(jié)合黃芪甲苷和芒柄花素等指標(biāo)，考察不同純化工藝對(duì)參芪扶正方中有效成分的影響，探討更為有效的中藥純化技術(shù)及其評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100液相色譜儀系列(美國(guó)，二極管陣列檢測(cè)器)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech 3300)，H.S.G-IIB-4電熱恒溫水浴鍋(上海儀表(集團(tuán))供銷公司)，BS124S電子天平(Sartorius)，BP211D電子分析天平(Sartorius，十萬分之一)，DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芪藥材(批號(hào)080707)、黨參藥材(批號(hào)080908)均由麗珠集團(tuán)利民制藥廠提供;黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-200613)和芒柄花素(批號(hào)111703-200501)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;D101型大孔吸附樹脂(上海樹脂廠);聚酰胺(批號(hào)20090617，浙江臺(tái)州路橋四甲生化塑料廠);乙腈為色譜純，水為三蒸水;甲醇、乙醇、磷酸等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 參芪水煎液制備 黨參、黃芪藥材各400 g，加水煎煮3次，第1次加水10倍煎煮1 h，第2次加水8倍煎煮1 h，第3次加水6倍煎煮0.5 h，過濾，合并濾液，濃縮制成含生藥1.0 g/mL的藥液，備用。

2.2 水提醇沉法

2.2.1 一次醇沉法:吸取參芪水煎液3份，每份20 mL，分別加入乙醇使含醇量達(dá)50%、60%和70%，邊加邊攪拌，靜置24 h以上，過濾，濾液回收乙醇后用水定容50 mL(相當(dāng)于生藥0.4 g/mL，下同)，備用。

2.2.2 二次醇沉法:吸取參芪水煎液20 mL，加入乙醇使含醇量達(dá)60%，邊加邊攪拌，靜置24 h以上，過濾，濾液濃縮回收乙醇至含生藥2 g/mL，再加入乙醇使含醇量達(dá)80%，充分?jǐn)嚢韬箪o置24 h以上，過濾，濾液回收乙醇后用水定容50 mL，備用。

2.3 聚酰胺法 分別稱取處理好的聚酰胺(100～200目)3份，每份2.5 g，濕法裝柱(柱長(zhǎng)20 cm，直徑1.1 cm)，分別精密吸取參芪水煎液2 mL上柱，用水洗脫至流出液無色，棄去，分別用50 mL不同濃度乙醇(30%、50%、70%)洗脫，收集洗脫液，濃縮，用水定容5 mL，備用。

2.4 D101大孔樹脂法 分別稱取D101大孔樹脂3份，每份2.5 g，乙醇浸泡24 h后裝柱(柱長(zhǎng)20 cm，直徑1.1 cm)，用乙醇反復(fù)洗脫，洗至洗脫液與水(1:2)混合不產(chǎn)生混濁，再用水反復(fù)洗至流出液無乙醇味，分別精密吸取參芪水煎液2 mL上柱，預(yù)吸附0.5 h，用水洗脫至流出液無色，棄去，分別用50 mL不同濃度乙醇(30%、50%、70%)洗脫，收集洗脫液，濃縮，用水定容5 mL，備用。

2.5 含量測(cè)定及指紋圖譜分析方法

2.5.1 色譜條件:Agilent ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～2 min，5.0% ～5.0%(A)，2 ～30 min，5.0% ～60%(A)，30 ～32 min，60% ～60%(A);流速:1.0 mL/min;運(yùn)行時(shí)間32 min;紫外吸收波長(zhǎng)254 nm;蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件:溫度40℃，氣體流速1.5 mL/min，增益為1。該色譜條件同時(shí)用于含量測(cè)定和指紋分析。

2.5.2 芒柄花素對(duì)照品溶液及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取芒柄花素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含26 μg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、5、8、10 μL 注入高效液相色譜儀，測(cè)定，以進(jìn)樣量(X，μg)對(duì)峰面積(Y，A)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，芒柄花素進(jìn)樣量在0.026～0.260 μg范圍呈良好的線性，回歸方程為 y=5 152.3x－101.39，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9。

2.5.3 黃芪甲苷對(duì)照溶液及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取經(jīng)105℃干燥2 h的黃芪甲苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含57 μg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液 1、2、5、8、10 mL 加甲醇定容至10 mL，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.057～0.570 μg范圍呈良好的線性，回歸方程為 y=0.946 4x+5.736 4，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 精密度實(shí)驗(yàn):分別精密吸取芒柄花素和黃芪甲苷對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，重復(fù)5次，測(cè)得芒柄花素的峰面積RSD為0.68%(n=5)，黃芪甲苷的峰面積RSD為0.85%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.5.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):精密吸取2.3項(xiàng)下70%乙醇洗脫制得的供試品溶液 20 μL，分別在 0、2、6、12、24 h間隔進(jìn)樣，測(cè)得芒柄花素和黃芪甲苷的峰面積RSD分別為0.98%和1.12%(n=5)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):按2.3項(xiàng)下70%乙醇洗脫方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣分析，測(cè)得芒柄花素和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為1.25%和1.36%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性好。

2.5.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn):取2.3項(xiàng)下70%乙醇洗脫方法制得的已知含量的純化液各6份，按1∶1比例分別加入芒柄花素和黃芪甲苷混合對(duì)照品溶液，按2.5.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定其含量，計(jì)算加樣回收率。芒柄花素和黃芪甲苷的加樣回收率結(jié)果分別為98.56%，RSD=1.52%(n=6)和 97.32%，RSD=1.91%(n=6)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)處理方法回收率良好。

2.5.5 供試品溶液的制備和測(cè)定:吸取上述制得的純化液5 mL，分別置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液各20 μL，注進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，分析，計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜分析結(jié)果

通過對(duì)參芪不同純化液進(jìn)行高效液相紫外光譜和蒸發(fā)光散射檢測(cè)圖譜進(jìn)行聯(lián)合分析，結(jié)果表明，在紫外波長(zhǎng)254 nm處指紋圖譜中最多共分離出13個(gè)信息峰(見圖1)，各峰分離度好，塔板數(shù)較高，13號(hào)峰為芒柄花素峰;蒸發(fā)光散射指紋圖譜中最多共分離出17個(gè)信息峰(見圖1)，各峰基本能夠達(dá)到基線分離，10號(hào)峰為黃芪甲苷峰，蒸發(fā)光散射指紋圖譜反映信息較多，但峰值高度不及紫外光譜吸收指紋圖譜中各峰明顯。

圖1 高效液相色譜UV和ELSD分析指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint by UV and ELSD

3.2 水提醇沉純化結(jié)果

由圖2和圖3可見，不同醇沉工藝中出峰數(shù)量基本相似，其中二次醇沉工藝純化效果相對(duì)要優(yōu)于其他一次醇沉工藝，主要表現(xiàn)在蒸發(fā)光散射指紋圖譜中黑色箭頭所指部分和保留時(shí)間2～10 min部分基線情況，醇沉濃度越低基線漂移和噪音越高，采用二次醇沉工藝能夠較好去除雜質(zhì)，基線較為平穩(wěn)，但仍存在較大噪音。且醇沉工藝仍存在較多的多糖類成分(見圖中白色箭頭所指)。

3.3 聚酰胺純化結(jié)果

由圖2和圖3可見，乙醇濃度越高，洗脫力越強(qiáng)，出峰信息越多，保留時(shí)間越長(zhǎng)峰值越高。從出峰個(gè)數(shù)和峰高度看，70%醇洗工藝與50%醇洗工藝基本相似，30%醇洗工藝較差，可見50%乙醇已可將大多成分從聚酰胺柱中洗脫下來。30%乙醇、50%乙醇和70%醇均能將黃芪甲苷和芒柄花素成分洗脫下來。通過聚酰胺柱吸附成分后，各純化液在蒸發(fā)光散射指紋圖譜中白色箭頭和黑色箭頭所指部分基本消失，保留時(shí)間2～10 min部分基線情況也變得平整?？梢娋埘０穼?duì)參芪水煎液具有更好的純化作用，以50%以上乙醇才能達(dá)到優(yōu)質(zhì)洗脫效果。

3.4 D101大孔樹脂純化結(jié)果

由圖2和圖3可見，大孔樹脂柱中不同乙醇濃度的洗脫情況基本類似于聚酰胺柱。從出峰個(gè)數(shù)和峰高度看，70%醇洗工藝>50%醇洗工藝>30%醇洗工藝;以芒柄花素評(píng)價(jià)，其峰高以70%醇洗工藝最高，30%醇洗工藝最低;以黃芪甲苷評(píng)價(jià)，70%乙醇能很好將黃芪甲苷為代表的皂苷類成分洗脫下來，50%乙醇只能洗脫部分下來，30%基本洗脫不下黃芪甲苷成分。通過大孔樹脂柱吸附成分后，各純化液在蒸發(fā)光散射指紋圖譜中黑色箭頭所指部分和保留時(shí)間2～10 min部分基線情況基本類似，而白色箭頭所指部分基本去除，以70%乙醇洗脫效果最佳。

3.5 三類純化工藝比較結(jié)果

通過對(duì)上述各種純化工藝進(jìn)行比較(見表1、圖2和圖3)，結(jié)果顯示，水提醇沉法所得純化液的干固物最多;D101大孔樹脂法所得純化液的干固物大幅降低，成分隨洗脫乙醇濃度增大而增高，對(duì)黃芪甲苷等皂苷類成分的吸附力強(qiáng)于芒柄花素等黃酮類成分;聚酰胺法純化效果最佳，所得純化液干固物最低，溶液顏色最淺，有效成分含量高，對(duì)芒柄花素等黃酮類成分的吸附力強(qiáng)于黃芪甲苷等皂苷類成分。

表1 三類不同工藝純化效果比較Tab.1 Purification effect comparison of three types of different technologies

圖2 不同工藝純化液高效液相紫外光譜指紋圖譜Fig.2 HPLC-UV fingerprint of purification liquid by different technologies

圖3 不同工藝純化液高效液相蒸發(fā)光散射指紋圖譜Fig.3 HPLC-ELSD fingerprint of purification liquid by different technologies

4 結(jié)論與討論

綜上所述，以聚酰胺法有效成分含量最高，溶液顏色最淺，干固物量明顯低于另兩種方法，對(duì)芒柄花素等黃酮類成分的吸附力強(qiáng)于黃芪甲苷等皂苷類成分;D101大孔樹脂吸附法次之，對(duì)黃芪甲苷等皂苷類成分的吸附力反而強(qiáng)于芒柄花素等黃酮類成分;水提醇沉法所得純化液的干固物量最高。由此可見，在參芪扶正方提取純化研究方面，聚酰胺法既可降低出膏量，又可很好地保留皂苷類、黃酮類等有效成分，可作為該方工藝改進(jìn)的良好純化方法。參芪扶正方中還含有大部分多糖類成分，該類成分有待單獨(dú)進(jìn)一步研究，聚酰胺和大孔樹脂對(duì)皂苷類和黃酮類成分的吸附力不同，可考慮聯(lián)合應(yīng)用研究，有待進(jìn)一步探索。

UV指紋圖譜研究結(jié)果表明，在紫外波長(zhǎng)254 nm處指紋圖譜中共分離出13個(gè)信息峰，UV指紋圖譜圖能夠較好反映參芪不同工藝純化液中具有紫外吸收成分的保留情況，但難以更為直接的反映純化液中各成分的相對(duì)含量，對(duì)于無發(fā)光團(tuán)的成分難以評(píng)價(jià)，特別是雜質(zhì)。

ELSD指紋圖譜研究結(jié)果表明，在蒸發(fā)光散射指紋圖譜中共分離出17個(gè)信息峰，蒸發(fā)光散射指紋圖譜反映信息更多，從峰面積和峰高便能更好的反映各種成分的量。在參芪扶正方的研究中可知，蒸發(fā)光散射指紋圖譜能夠較好反映參芪不同工藝純化液中有無發(fā)光團(tuán)成分的保留情況甚至雜質(zhì)的去除狀況，如圖中白色箭頭主要反映多糖類成分，黑色箭頭和10分鐘之前的基線噪音大小提示純化液中雜質(zhì)的去除情況。通過兩種圖譜比較，除了10′為黃芪甲苷外，在蒸發(fā)光散射指紋圖譜中的 7′、8′、11′、12′、13′、14′、15′、16′、17′號(hào)峰在紫外吸收指紋圖譜未見吸收峰，可能為皂苷類成分。

中藥及其復(fù)方提取物純化效果評(píng)價(jià)方法一直是業(yè)界關(guān)注和探討的重點(diǎn)和難點(diǎn)，且評(píng)價(jià)層次和要求越來越高，以高效液相色譜指紋圖譜法為最有效的評(píng)價(jià)手段之一，多以UV指紋圖譜評(píng)價(jià)，在ELSD指紋圖譜評(píng)價(jià)方面較鮮見，且UV檢測(cè)器只針對(duì)具有發(fā)色團(tuán)成分，雖然UV光譜圖具有很好的信號(hào)特征，但其低波長(zhǎng)在急變梯度條件下受基線漂移困擾。而ELSD響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性，對(duì)所有進(jìn)入的物質(zhì)均可檢測(cè)，其響應(yīng)值只與物質(zhì)的量有關(guān)，能更好反映提取液的純凈程度，特別是對(duì)一些雜質(zhì)去除具有一定的響應(yīng)信息。

本文研究結(jié)果可為中藥及其復(fù)方制劑提取純化評(píng)價(jià)方法提供基礎(chǔ)和依據(jù)。雖然ELSD指紋圖譜能更好的反映提取液的純化情況和各個(gè)成分的量，但對(duì)含量較低且具有發(fā)色團(tuán)的成分，其響應(yīng)值不及紫外光譜明顯。故筆者建議，在中藥及其復(fù)方制劑提取純化評(píng)價(jià)方面可采用ELSD指紋圖譜聯(lián)合UV指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，才能更好更多提供提取液純化后的質(zhì)量信息。

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