犬肝臟中戊型肝炎病毒抗原的檢測及組織病理學(xué)觀察

李睿文,周 寅,佘銳萍*,李豐昌,尹 君,毛晶晶,孫 泉

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100094;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州 073000;3.北京永昌動物醫(yī)院,北京 100000)

犬肝臟中戊型肝炎病毒抗原的檢測及組織病理學(xué)觀察

李睿文1,2,周 寅1,佘銳萍1*,李豐昌3,尹 君1,毛晶晶1,孫 泉1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100094;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州 073000;3.北京永昌動物醫(yī)院,北京 100000)

為探討寵物犬戊型肝炎病毒(HEV)的感染情況,試驗采集了21例寵物犬肝臟,采用免疫組織化學(xué)染色方法對上述肝臟組織中的HEV-Ag進行了檢測,同時應(yīng)用H.E染色和M allory三染色法對其病理形態(tài)學(xué)變化進行了觀察。結(jié)果表明在21例寵物犬肝臟中均檢出了HEV抗原。組織病理學(xué)觀察可見肝臟有明顯的炎癥變化。提示寵物犬感染HEV程度很高,并且是人感染HEV潛在傳染源,具有重要的公共衛(wèi)生意義。

寵物犬;戊型肝炎;免疫組織化學(xué);組織病理學(xué)

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性病毒性疾病,主要通過糞-口途徑傳播[1]。戊型肝炎以其水源性暴發(fā)流行和急性散發(fā)為特點,呈全球分布,流行地區(qū)主要為發(fā)展中國家,在發(fā)達國家的發(fā)病率呈散發(fā)狀態(tài)。歷史上先后在東南亞、中亞、中東、北非和西非以及墨西哥等國發(fā)生50余次疫情[2-3]。中國是戊肝的高發(fā)地區(qū),迄今為止已暴發(fā)11次,其中以1986年-1988年我國新疆南部地區(qū)發(fā)生戊型肝炎水型流行最為嚴重,共計發(fā)病119 280例,死亡707例,是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行,造成了巨大的社會危害和經(jīng)濟損失[4]。人群感染后死亡率在0.5%～3%之間,孕婦感染病情較重,病死率高達5%～25%。

自1997年Meng等人分離到第一株動物HEV毒株——豬HEV[5],現(xiàn)已證實非人靈長類動物豬、鹿、牛、羊、犬貓以及魚可感染HEV[6-10],因此認為戊型肝炎是一種人畜共患疾病,但是動物在戊型肝炎的傳播中起何作用現(xiàn)還不是十分清楚。據(jù)報道上海地區(qū)犬血清中HEV-IgG陽性率為17.82%和21.40%[11-12],福建地區(qū)犬血清中HEV-IgG陽性率為38.78%,青海地區(qū)犬血清中HEV-IgG陽性率為50%以上。上述證據(jù)表明犬可能感染HEV,但至今為止還沒有從犬分離到HEV。近年來.寵物行業(yè)作為新興都市化產(chǎn)業(yè)已見雛形,并且得到了較快的發(fā)展。其中寵物犬的飼養(yǎng)數(shù)量位居寵物第一位,人與寵物犬的關(guān)系越來越密切.與寵物犬接觸的人群數(shù)量越來越大,但有關(guān)寵物犬感染HEV后肝臟中抗原(HEV-Ag)分布及其對肝臟的病理損傷還未見報道。為初步探討寵物犬HEV的感染情況,本研究通過對寵物犬肝臟進行免疫組織化學(xué)染色、HE染色和M allory三色染色,統(tǒng)計寵物犬肝臟內(nèi)戊型肝炎相關(guān)抗原的陽性率,以及戊型肝炎病毒感染對肝臟造成的病理損傷等,為深入研究HEV提供流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 寵物犬肝臟的來源 21份肝臟組織由北京市多家動物醫(yī)院提供,多聚甲醛-戊二醛混合固定液中固定,犬源為寵物犬,生前狀況不完全清楚。

1.1.2 試劑 兔抗人HEV多克隆抗體(一抗)、二抗及其他免疫組化試劑均購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理組織切片制作和免疫組織化學(xué)染色按常規(guī)石蠟切片制作技術(shù)連續(xù)切片,分別進行HEV免疫組織化學(xué)染色、蘇木素-伊紅染色及M allory三色染色法。蘇木素-伊紅染色和M allory三色染色法按常規(guī)方法進行,免疫組織化學(xué)染色方法按試劑操作說明書進行。陰性染色對照不加一抗。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定 在顯微鏡下,HEV免疫組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)信號為棕紅色或棕黃色團塊狀或顆粒狀。

2 結(jié)果

2.1 犬肝臟中HEV-Ag免疫組化檢測結(jié)果

肝臟組織HEV免疫組化檢測結(jié)果見表1。由表1可見,21例肝臟組織HEV免疫組化檢測陽性率為100%。雖然犬肝臟中HEV-Ag免疫組織化學(xué)陽性檢出率為100%,但犬肝臟組織內(nèi)HEV-Ag免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)信號的強弱不盡相同,其中強陽性的有13例,占被檢樣品總數(shù)的61.90%;中等陽性的有6例,占總數(shù)的28.57%;弱陽性的有2例,占總數(shù)的9.52%。

表1 犬肝臟中HEV-Ag免疫組化檢測結(jié)果Table 1 The results of detection of HEV-Ag by immunohistochem icalmethod in pet dogs'liver|

2.2 犬肝臟中HEV-Ag的分布定位

HEV-A g免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)信號呈顆粒狀彌散于肝細胞胞漿內(nèi),或胞核(圖1A)。免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HEV-Ag呈陽性反應(yīng)的肝臟具有相同的特征,即位于肝被膜附近的肝組織中,陽性反應(yīng)信號散在分布,常常僅見肝細胞核呈明顯的陽性反應(yīng),胞漿多呈陰性反應(yīng);遠離被膜的肝組織,陽性反應(yīng)信號常成片分布,胞漿多呈陽性反應(yīng),而胞核卻較少呈陽性反應(yīng)。有時,在一個雙核的肝細胞內(nèi)?？梢粋€核呈陽性反應(yīng),另一個呈陰性反應(yīng)。在肝小葉的周邊區(qū),陽性反應(yīng)信號常散在分布,且常出現(xiàn)于核內(nèi)。間質(zhì)淋巴細胞呈陰性反應(yīng)(圖1B)。匯管區(qū)的小葉間動脈和靜脈的內(nèi)皮細胞及小葉間膽管上皮細胞均呈陽性反應(yīng)。在不加一抗的陰性染色對照片未見任何陽性反應(yīng)信號(圖1C)。

2.3 HEV-Ag免疫組化檢測陽性肝臟病理組織學(xué)觀察

光鏡觀察發(fā)現(xiàn),所觀察的21例肝臟組織均有不同程度的病理變化。常見淋巴細胞等炎性細胞浸潤(圖2A),肝臟細胞氣球樣變,散在的核固縮性壞死細胞(圖2B),匯管區(qū)膽管增生,纖維結(jié)締組織增生等(圖 2C)。

21例肝臟組織病理學(xué)變化分類統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可以看出,100%的肝臟出現(xiàn)了肝細胞變性,85.71%的肝臟肝細胞發(fā)生單個核固縮性壞死,28.57%肝臟中出現(xiàn)局限性壞死灶,100%的肝組織中見有淋巴細胞等炎性細胞浸潤,71.43%的肝臟匯管區(qū)有膽管增生。

圖1 犬肝臟中HEV-Ag顯示,陽性信號為棕黃色顆粒,A、B為HEV陽性肝臟,C為HEV陰性對照,染色過程中不加一抗,40×Fig.1 HEV antigen was detected in the hepatocytes from naturally in fected pet dogs.Immunoh istochemistry,Brown substrate,haematoxylin coun terstain(40×)

圖2 犬肝臟HEV免疫組化陽性肝組織的H.E.染色切片觀察,40×Fig.2 The H istopathologic observation on positive livers from pet dogs,hematox ylin-eosin staining,40×

表2 21例肝臟組織病理學(xué)變化分類統(tǒng)計Table 2 The resu lts of Pathological changes in 21 livers from pet dogs

2.4 M allory三色染色法染色觀察

M allory三色染色法染色結(jié)果表明,在21例犬肝臟中,鏡檢發(fā)現(xiàn)71.43%(15/21)的肝組織中纖維結(jié)締組織增生,并且發(fā)現(xiàn)纖維組織隨炎癥反應(yīng)伸入肝小葉,并見有網(wǎng)狀纖維膠原化的趨勢(圖3)。

圖3 犬肝臟組織的Mallory三染色切片觀察,20×Fig.3 The H istopathologic observation on positive livers from pet dogs,Mallory staining,20×

3 討論

戊型肝炎是一種人畜共患疾病,已從多種動物分離到HEV,雖然有資料表明寵物犬血清中存在HEV-IgG,提示寵物犬也可感染HEV,但是還未見從寵物犬分離到毒株[13-14]。據(jù)Renou C等報道[15],在法國,HE病人可能是由其寵物豬感染所引起的,Kuno在調(diào)查一急性戊型肝炎患者的病史時發(fā)現(xiàn),和病人住在一起的家庭成員HEV IgG、IgM呈陰性,而他的寵物貓IgG卻為陽性[16]。寵物與人類接觸密切,提示寵物可能是散發(fā)性 HE的潛在傳染源。而寵物犬,作為一種常見的人類伴侶動物,其疾病的控制不僅關(guān)系到動物本身的健康,而且會影響到人類的健康。

本試驗用抗人HEV的抗體,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測寵物犬肝臟中戊型肝炎病毒抗原,結(jié)果發(fā)現(xiàn)21例寵物犬肝臟中發(fā)現(xiàn)HEV Ag強陽性率為61.90%,一般陽性率為 28.57%,弱陽性率為9.52%,總陽性率為100%,表明在寵物犬中HEV的感染非常普遍。本研究對北京地區(qū)的寵物犬肝臟的HEV抗原檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),由于寵物犬肝臟的來源于北京多家動物醫(yī)院,犬源多為寵物犬,與人類接觸密切,很可能是人與犬在日常生活中互相傳播感染HEV;并且試驗中采用的一抗為兔抗-人HEV抗體,在犬肝臟中檢測出了如此高的HEV抗原,表明寵物犬的HEV和人的 HEV有很大的相關(guān)性。這又為戊型肝炎的跨種間傳播和其人畜共患性提供了有力的證據(jù)。

人感染HEV后表現(xiàn)為急性肝炎癥狀,一般起病急,黃疸多見。感染HEV的病理變化主要為肝細胞氣球樣變,嗜酸性變、灶狀壞死及淋巴細胞、單核細胞浸潤[17]。電鏡檢查,肝細胞腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,線粒體形態(tài)異常,糖原減少,HEV顆粒散在于胞漿基質(zhì)中。豬感染HEV后,免疫組化陽性信號及病變與人基本一致[18]。研究對21例HEV免疫組化陽性反應(yīng)肝組織的病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)所有肝組織中見有淋巴細胞等炎性細胞浸潤、肝細胞變性,85.71%的肝臟出現(xiàn)了散在單個核固縮性壞死,接近72%的肝臟出現(xiàn)肝竇、狄氏隙擴張,90.48%的肝臟匯管區(qū)膽管和纖維結(jié)締組織增生。免疫組化陽性的寵物犬肝臟的Mallory三色染色結(jié)果顯示肝組織中纖維結(jié)締組織增生,并且發(fā)現(xiàn)纖維組織隨炎癥反應(yīng)伸入肝小葉,有網(wǎng)狀纖維膠原化的趨勢。本研究中組織病理學(xué)的觀察結(jié)果與人的HE的病理變化基本一致。結(jié)果表明HEV的感染對肝臟造成了明顯的損傷作用,表現(xiàn)有纖維化的趨勢。但HEV如何對肝臟組織造成損傷的具體機理還需進一步研究。

綜上所述,HEV在寵物犬中感染程度非常高,而且組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明寵物犬感染HEV后對肝臟的損傷與人的基本一致,這些表明寵物犬可能是人感染HEV潛在傳染源。家養(yǎng)動物與人類接觸密切,有將HEV傳播給人的機會,其排泄的糞便更有污染水源的可能,尤其是寵物犬感染HEV后常表現(xiàn)為亞臨床狀態(tài),不易引起人們的注意,因此更具有傳播戊型肝炎的潛在危險性。所以,應(yīng)加強對寵物犬感染HEV的監(jiān)測,以更好地防止戊型肝炎的蔓延。

[1] Emerson SU,Pu rcellR H.H epatitis E[J].Pediatr Infect Dis J,2007,26:1147-1148.

[2] Panda S K,Thak ral D,Rehman S.Hepatitis E virus[J].Rev Med V irol,2007,17:151-180.

[3] Khuroo M S.H epatitis E virus[J].Curr Opin Infect Dis,2008;21:539-543.

[4] 佘銳萍.病毒性肝炎--值得警惕的重要人獸互傳病[N].科技導(dǎo)報,2007:25.

[5] M eng X J,Purcell R H,Halbu r P G,et al.A novel virus in sw ine is closely related to the hum an hepatitis E virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:9860-9865.

[6] 周錦萍.上海地區(qū)多種動物中戊型肝炎病毒感染狀況調(diào)查//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集[C].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[7] 邢建民,傅國璋,蘇貴軍.青海省畜禽戊型肝炎感染情況的檢測[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(1):65-66.

[8] 嚴延生,王惠榕,王靈嵐,等.福建省戊型肝炎病毒感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志,2007,28(2):105-108.

[9] LiW,She R,W ei H,et al.Prevalence of hepatitis E virus in sw ine under different breeding environm ent and abattoir in Beijing,China[J].Vet M icrobiol,2009,133:75-83.

[10] 李文貴,佘銳萍,韋海濤.屠宰豬肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37(11):921-925.

[11] 瞿浩生,施建標,倪惠軍,等.上海浦東地區(qū)犬戊型肝炎病毒流行情況調(diào)查[J].中國動物檢疫,2007,24(6):30.

[12] 劉俊峰,華修國,張 文,等.上海地區(qū)寵物犬中戊型肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(14):5895-5896.

[13] Liu J,ZhangW,Shen Q,et al.Prevalenceof antibody to hepatitis E virus am ong pet dogs in the Jiang-Zhe area of China[J].Scand J Infect Dis,2009(41):291-295.

[14] 丁 福,孟繼鴻,張?zhí)m芳,等.與人類關(guān)系密切的7種動物對戊型肝炎病毒易感性的初步研究[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(1):52-55.

[15] Renou C,Cadranel JF,Bou rliere M,et al.Possible zoonotic transm ission of hepatitis E from pet pig to its ow ner[J].Emerg Infect Dis,2007,13:1094-1096.

[16] Kuno A,Ido K,Isoda N,et al.Sporadic acute hepatitis E of a 47-year-old man whose pet cat was positive for an tibody to hepatitis E virus[J].H epatology Research,2003,26:237-242.

[17] 王淑穎,阮 冰,任國平,等.散發(fā)性戊型肝炎病理特征的初步觀察[J].肝臟,2001,6(4):16-18.

[18] 王英華,韋海濤,余銳萍.屠宰豬肝臟中戊型肝炎病毒(HEV)的檢測及組織病理學(xué)觀察[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2008,16(3):373-379.

Detection of the Hepatitis E Virus(HEV)Antigen and Histopathologic Observation in Liver of Pet Dog

Li Rui-wen1,2,ZHOU Yin1,SHE Rui-ping1,YIN Jun1,MAO Jing-jing1,SUN Quan1

(1.College of Veterinary M edicine,China Agr iculture University,Beij ing,100094,China;2.Collegeof T rad itional
Veterinary M ed icine,H ebei Agricu ltura l University,Dingzhou,072000,Ch ina;3.Yong chang Pet H osp ital of Beijing,100000,China)

In order to invest the prevalence of HEV in pet dogs,21 liversof dogwere collected to detect the hepatitis E virus(HEV)antigen by imm unohistochem icalm ethod,and observe pathological changes o f dog's liver by HE staining and Mallory's staining.The results show that 21 livers of pet dogmay be detected HEV-Ag,and positive ratew as 100%;and the histopathologic changes of the livers of pet dog consistent w ith the pathologic changes of liver o f human that in fected HEV.It can be seen that the p revalence o f HEV is high degree in pet dogs.The pet dogs infected HEV Is a potential source to infect human,and it is isignificancem t in pub lic health.

pet dog;hepatitis E virus;immunohistochemicalmethod;histopathology

S852.31

A

1007-5038(2010)04-0058-05

2010-04-06

國家自然科學(xué)基金資助項目(項目編號:30871853)

李睿文(1976-),男,河北易縣人,在讀博士,主要從事人畜共患疾病研究。*通訊作者