蘇丹紅?對(duì)大鼠肝損傷及CYP 1A 1表達(dá)的影響

嚴(yán)玉霖,高 洪,孫文匯,高利波,趙 汝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

蘇丹紅?對(duì)大鼠肝損傷及CYP 1A 1表達(dá)的影響

嚴(yán)玉霖,高 洪*,孫文匯,高利波,趙 汝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

為探討蘇丹紅?(Sudan?)對(duì)大鼠肝臟損傷及細(xì)胞色素CYP 1A 1表達(dá)的影響,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(C組)和 Sudan?處理組,其中 Sudan?處理組分為 4個(gè)劑量處理組:?組(265 mg/kg)、ò組(530 mg/kg)、ó組(795mg/kg)和?組(975mg/kg),連續(xù)飼喂10天后采集肝臟作為檢測(cè)樣本。常規(guī)病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察Sudan?對(duì)肝細(xì)胞的損傷情況,運(yùn)用免疫組化技術(shù)研究Sudan?對(duì)CYP 1A 1表達(dá)的影響。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),Sudan?處理組肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,超微結(jié)構(gòu)變化為肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有脂肪滴,免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示:Sudan?處理組肝臟CYP 1A 1基因表達(dá)蛋白的積分光密度極顯著高于C組(P＜0.01),且在一定劑量范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。結(jié)果表明,Sudan?能夠上調(diào)CYP 1A 1基因的表達(dá),從而發(fā)揮各種毒性效應(yīng),最終導(dǎo)致肝臟損傷。

蘇丹紅?;肝損傷;細(xì)胞色素CYP 1A 1

近年來(lái)食品中的蘇丹紅事件層出不窮,給食品安全帶來(lái)了新的隱患。2003年5月,法國(guó)首先發(fā)現(xiàn)了從印度進(jìn)口的紅辣椒粉制品中含蘇丹紅?(Sudan ?),2005年2月,英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)署(Food StandardAgency,FSA)在其網(wǎng)站上分布了30家企業(yè)生產(chǎn)的可能含有致癌物質(zhì)蘇丹紅色素的359個(gè)品牌的食品,向消費(fèi)者發(fā)出警告,引發(fā)了全球的/蘇丹紅0風(fēng)暴。隨后中國(guó)政府也對(duì)蘇丹紅下達(dá)了追殺令,亨氏、肯德基等知名跨的國(guó)公司相繼被查出在所生產(chǎn)的食品中含有Sudan?,同時(shí)在辣椒調(diào)味品、雞蛋及唇膏等產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)Sudan?[123]。Sudan?是一類人工合成的親脂性偶氮化合物,常作為一種工業(yè)原料被廣泛用于如溶劑、油脂、蠟、汽油的增色及鞋、地板等增光方面,1896年科學(xué)家達(dá)迪將其命名為蘇丹紅并沿用至今。Sudan?在世界許多國(guó)家都被明令禁止用于食品生產(chǎn)中,但由于其具有良好的光澤持久性與穩(wěn)定性,被喪失良知的不法商販用于改善食品的感官色澤,因此食品中的Sudan?給人類健康構(gòu)成了潛在的嚴(yán)重威脅。

肝臟是機(jī)體內(nèi)最重要的解毒器官,已有研究證實(shí)肝臟是Sudan?產(chǎn)生作用的主要靶器官,Sudan?能夠引起小鼠、大鼠、家兔的肝臟產(chǎn)生腫瘤[4]。進(jìn)入體內(nèi)的Sudan?主要通過(guò)胃腸道微生物還原酶、肝和肝外組織微粒體和細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素還原酶系(如細(xì)胞色素P450)和過(guò)氧化氫2過(guò)氧化物酶體系進(jìn)行代謝[4,5]。人和鼠的CYP 1A 1是細(xì)胞色素P450基因組中研究較為清楚的兩個(gè)功能基因,研究表明CYP 1A 1基因編碼P450蛋白酶,此酶能催化藥物的代謝以及膽固醇、類固醇和某些脂類的合成,同時(shí)也是某些毒素物質(zhì)的主要代謝酶[6],因此研究Su2 dan?進(jìn)入機(jī)體后對(duì)肝損傷和CYP 1A 1基因表達(dá)的影響對(duì)闡明Sudan?的毒性機(jī)理具有重要意義。

本研究采用Sudan?處理大鼠建立蘇丹紅中毒模型,通過(guò)病理組織切片,電子顯微技術(shù)及免疫組織化學(xué)(Imm unohistochem istry,IHC)技術(shù)分析Sudan ?對(duì)的大鼠肝臟組織的病理?yè)p傷、肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷及肝細(xì)胞中CYP 1A 1基因表達(dá)的變化,探討Sudan?的毒性和致病機(jī)理,從比較醫(yī)學(xué)角度為Su2 dan?對(duì)人類健康可能造成的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Sudan?為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;焦炭酸二乙酯(diethy lprocarbonate,DEPC)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;CYP 1A 1多克隆抗體由上海晶天生物科技有限公司提供;APES為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;所用無(wú)水乙醇、二甲苯、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、蘇木精、曙紅Y、中性樹(shù)膠等試劑,均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理

30只清潔級(jí)SD大鼠(由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供),體重140～160 g/只,雌雄不拘。臨床檢查確認(rèn)健康后,單籠、顆粒飼料預(yù)飼養(yǎng)3 d,自由飲水,編號(hào)并隨機(jī)分為對(duì)照組(C組,n=6@1)和Sudan?處理組(n=6@4)。將Sudan?與飼料按一定比例充分混勻配制成顆粒飼料,分別以四個(gè)劑量飼喂Sudan? 處理組:?組(265 mg/kg)、ò組(530mg/kg)、ó 組(795 mg/kg)和 ? 組(975 mg/kg)。另設(shè)空白對(duì)照組飼以普通顆粒飼料,連續(xù)飼喂10 d。

1.3 肝臟常規(guī)病理組織切片的制備及觀察

肝臟組織切成4 mm厚薄,在100 m L/L中性甲醛固定液中固定48 h以上,依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。包埋好的肝臟組織蠟塊用切片機(jī)切成4 L m的切片,貼在干凈載玻片上,37 e溫箱烤干,依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水,HE染色,采用改良的H arris蘇木素與沉淀酸化伊紅Y乙醇液染色,中性樹(shù)膠封片,在光鏡下觀察肝臟組織變化的性質(zhì)和程度。

1.4 肝組織超微切片的制備及觀察

大鼠處死后,迅速取肝切成1 mm3的肝組織5塊,于4 e預(yù)冷的3.5%戊二醛固定液中預(yù)固定,4 e保存。隨即選取承固定的組織1塊,漂洗后用10 m L/L餓酸后固定。丙酮逐級(jí)梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂812浸透、包埋,半薄切片、光鏡定位、修快,Lei2 ca2V型超薄切片機(jī)切片,檸檬酸鉛2醋酸鈾雙重染色,在JEM21011型透射電鏡下系統(tǒng)觀察肝細(xì)胞的形態(tài)變化性質(zhì)和程度。

1.5 肝組織中CYP 1A 1基因表達(dá)的檢測(cè)

采用SABC法檢測(cè)肝臟中CYP 1A 1的表達(dá)[728]:常規(guī)病理組織切片經(jīng)過(guò)滅活內(nèi)源性酶和熱修復(fù)抗原后,用50 g/L BSA封閉,滴加適當(dāng)濃度的CYP 1A1一抗37e,再滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,最后滴加試劑SABC。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色,加試劑盒中的A,B,C試劑各1滴,蒸餾水洗滌,蘇木精復(fù)染,10m L/L鹽酸酒精分化,水法返藍(lán),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。取正常對(duì)照組肝臟,自身對(duì)照染色步驟同上。鏡檢免疫組化染色切片,陽(yáng)性反應(yīng)信號(hào)呈棕褐色或棕黃色著染,細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。每個(gè)樣品隨機(jī)選取5個(gè)視野,40倍物鏡下觀察免疫組化陽(yáng)性物的分布,使用Image2Pro Plus 5.1測(cè)定以上樣品陽(yáng)性物質(zhì)所占積分光密度,并利用SPSS軟件進(jìn)行均數(shù)運(yùn)算和方差分析,分析試驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)以平均值( X)?標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,組間差異采取顯著性t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理組織學(xué)變化

對(duì)照組大鼠肝臟未見(jiàn)異常(圖1A)。隨著Su2 dan?添加劑量的增加,肝臟組織脂肪變性的程度也隨之惡化。?組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)單個(gè)的空泡(脂肪滴);ò組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪滴;ó組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)的小脂肪滴逐漸融合成大的脂肪滴,且數(shù)量較?組明顯增多(圖1B),?組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂肪滴的體積較ó組增大,數(shù)量增多。

2.2 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

對(duì)照組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常變化(圖1D),Sudan?作用組大鼠可見(jiàn)明顯的超微結(jié)構(gòu)病理變化(圖4),表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)大小不等脂肪滴,散在或積聚于細(xì)胞漿中,周圍細(xì)胞器被擠壓或變形。

圖1 肝臟Fig.1 Liver

2.3 肝臟組織CYP 1A 1基因表達(dá)的免疫組化結(jié)果

肝臟組織中CYP 1A 1基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 肝臟CYP 1A 1的表達(dá)(400@)Fig.2 The ex pression of CYP 1A 1 in liver(400@)

肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)的棕色陽(yáng)性物質(zhì)較ò組明顯增多,并且出現(xiàn)大小不等的脂肪顆粒

從圖2B可以看出,ó組肝細(xì)胞胞漿內(nèi) CYP 1A 1基因的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增多。

肝臟CYP 1A 1基因表達(dá)蛋白的積分光密度見(jiàn)表1和圖3。

從表1和圖3中可以看出,?、ò、ó和?組CYP 1A 1蛋白的積分光密度在一定劑量范圍內(nèi)呈增長(zhǎng)的趨勢(shì),極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

表1 肝臟CYP 1A 1的積分光密度Table1 The IOD of CYP 1A 1 in liver

圖3 肝臟CYP 1A 1的積分光密度Fig.3 The IOD of CYP 1A 1 in liver

3 討論

整個(gè)試驗(yàn)期間,對(duì)照組大鼠未見(jiàn)異常變化,毛富有光澤,食欲旺盛,精神活潑。Sudan?處理組大鼠,初期精神萎靡,食欲下降,幾天之內(nèi)便出現(xiàn)嚴(yán)重的體重下降,并伴隨有肌肉和脂肪組織的急劇減少,隨著劑量升高,后期出現(xiàn)精神亢奮。剖檢發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠肝臟未見(jiàn)異常;?組大鼠剖檢肝臟未見(jiàn)明顯異常變化,隨Sudan?劑量增加,大鼠肝臟腫大,質(zhì)地脆軟,色澤淡黃,切面結(jié)構(gòu)模糊,有油膩感。肝臟是機(jī)體內(nèi)Sudan?作用最主要的靶器官之一,肝臟的病理組織切片結(jié)果表明,對(duì)照組大鼠肝臟未見(jiàn)異常(圖1);?組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)單個(gè)的脂肪滴;ò組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪滴,且數(shù)量較?組增多;ó組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)的小脂肪滴逐漸融合成大的脂肪滴(圖2),?組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂肪滴的體積較ó組增大,數(shù)量增多。對(duì)肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果表明,對(duì)照組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常變化(圖3),Sudan?處理組大鼠可見(jiàn)明顯的超微結(jié)構(gòu)病理變化(圖4),表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)大小不等脂肪滴,散在或積聚于細(xì)胞漿中,周圍細(xì)胞器被擠壓或變形。表明Sudan?在早期主要對(duì)肝臟造成脂肪變性的組織細(xì)胞損傷,隨著病程的發(fā)展,可能進(jìn)一步形成肝硬化或肝癌。

本研究免疫組化的結(jié)果顯示,在對(duì)照組和Sudan?處理組(?、ò、ó和?組)肝臟均有CYP 1A 1基因的表達(dá),積分光密度分別是 102.404 32、204.469 69、304.921 69、620.565 76、465.769 26,說(shuō)明 Sudan?處理組肝臟CYP 1A 1基因的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P﹤0.01),在一定劑量范圍內(nèi)隨著Sudan?劑量的增加而增加。這一結(jié)果說(shuō)明Sudan?能夠顯著上調(diào) CYP 1A 1基因的表達(dá)。CYP 1A 1基因編碼CYP 450蛋白酶,此酶能催化藥物的代謝以及膽固醇、類固醇和某些脂類的合成。該基因的表達(dá)被某些多環(huán)芳香碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)活化,繼而將其代謝成有毒的中間物[5,9]。CYP 1A 1被證實(shí)在Sudan?的代謝過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用,能將Sudan?代謝為活性物質(zhì),進(jìn)而與DNA發(fā)生加合反應(yīng),形成DNA加合物,導(dǎo)致基因毒性[10211]。同時(shí),Sudan?在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物苯胺也能夠損害肝臟,引起中毒性肝病,還有可能誘發(fā)肝臟細(xì)胞基因發(fā)生變異[12]。

總之,Sudan?能夠引起肝臟組織細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,為Sudan?致肝臟損傷提供了形態(tài)學(xué)依據(jù),同時(shí)Sudan?能夠顯著上調(diào)大鼠肝臟CYP 1A 1基因的表達(dá),從而促進(jìn)Sudan?在體內(nèi)代謝成有毒物質(zhì),是導(dǎo)致Sudan?致肝臟損傷的重要機(jī)制之一。

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The Effect of Sudan?on Liver In jury and Exp ressions of CYP 1A1 in Rats

YAN Yu2lin,GAO Hong,SUN Wen2hui,GAO Li2bo,ZHAO Ru

Collegeof Animal Science and Technology,Yunnan Ag ricu ltural University,K unm ing,Yunan,650201,China)

In order to exp lore the effect of Sudan?on liver injury and expressionsof CYP 1A 1 in rats,ex2 perimental animals were random ly divided into two groups:control group(C group),Sudan?treatment group(?,ò,óa(chǎn)nd ? groups).A ll ratswere killed and their livers were collected to be detec ted after ten days.Compared w ith contralgroup,the tissue structure of livers in Sudan?treatment groups appeared fatty degeneration.M eanwhile the u ltrastructural changes weremarked by the fat d rops in liver cell cyto2 p lasm.The result of IHC exam ination show ed that IOD of CYP 1A 1 protein increased markedly(P＜0.01)in livers in Sudan?treatment groups and showed uptrend in certain dose range.The results indicated that Sudan?can up2regulate the expressions of CYP 1A 1 and educe various kinds of poisoning effects.Fi2 nally,Sudan?can lead to liver injury.

Sudan?;liver in jury;CYP450

S852.3

A

100725038(2010)0420031205

2010203226

嚴(yán)玉霖(1979-),男,四川省攀枝花市人,講師,博士,主要從事動(dòng)物病理學(xué)研究。*通訊作者