去甲斑蝥素對人肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制作用的實(shí)驗觀察

常 城 朱尤慶 梅娟娟

原發(fā)性肝癌作為1種發(fā)病率較高的消化道腫瘤[1]，由于患者早期無癥狀，大多數(shù)人就診時已是晚期，故其預(yù)后差、死亡率高。化療是治療肝癌必不可少的手段之一，但大多數(shù)化療藥物由于毒副作用大而限制了其臨床應(yīng)用。因此尋找高效、低毒的抗痛藥，仍是目前國內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)。

斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥蟲體，在 《本經(jīng)》中稱其性味辛、寒，有大毒，歸 肝、腎、胃、大 腸、小腸經(jīng)，具有攻毒蝕瘡，逐瘀散結(jié)的功效。斑蝥(cantharidin,CA)抗癌的主要有效成分為斑蝥素，對原發(fā)性肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等有一定療效，但由于對胃腸道等的毒性作用限制了其在臨床上的應(yīng)用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)系根據(jù)斑蝥素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，去1、2位甲基合成而得，不僅具有顯著的抗癌作用，且毒副作用較小，同時具有升白、保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。臨床上主要用于治療乳腺癌、食管癌及胃癌等[2～5]。鑒于肝癌的高發(fā)病率及NCTD在腫瘤治療中的重要作用，本研究探討了NCTD對肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制打下基礎(chǔ) 。

1 材料與方法

1.1 材料

NCTD購自Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)﹑二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙錠(PI)為南京凱基生物技術(shù)發(fā)展公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；蛋白酶 K (Proteinase K)購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤實(shí)驗中心提供。復(fù)蘇后置于含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(內(nèi)含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，37℃、5% CO2加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞生長抑制率的測定 采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞調(diào)增細(xì)胞濃度為1×105/ml。取96孔板，每孔加入200 μl上述細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度NCTD使終濃度為5、10、20和40 μg/ml，每濃度設(shè)3個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、36、48 h后，棄上清。每孔加入DMSO 150 μl，震蕩均勻，測 A570 nm值OD值，計算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率 (%)= (1-實(shí)驗組OD值均數(shù) /對照組OD值均數(shù))×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/ml,實(shí)驗組加入NCTD，終濃度分別為5、10、20和40 μg/ml，同時設(shè)立陰性對照，相同條件下培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5min,PBS洗2次，70%乙醇固定，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4 透射電鏡檢測 將細(xì)胞分為對照組和藥物組(NCTD 20 μg/ml)作用24 h后，消化細(xì)胞后將混懸液移入錐形塑料管中，1 000 r/min離心5 min,棄去上清液，加入胎牛血清1～2滴，離心5 min，棄去上清，沿管壁加入戊二醛固定液，4℃下預(yù)固定30 min，用細(xì)針管沿管壁在標(biāo)本周圍輕劃使成團(tuán)塊狀，使固定液充分滲入標(biāo)本底部，繼續(xù)固定2 h，然后按照常規(guī)電鏡標(biāo)本制作方法處理標(biāo)本，透射電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計方法采用方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 NCTD對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用

不同濃度NCTD作用HepG2細(xì)胞24、36及48 h后的細(xì)胞生長抑制率曲線見圖1。由圖1可見，隨著NCTD濃度升高，HepG2細(xì)胞生長抑制率逐漸升高。當(dāng)40 μg/ml NCTD作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長抑制率達(dá)到80%以上。

2.2 NCTD對HepG2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，不同濃度NCTD作用HepG2細(xì)胞24 h后，G2/ M期細(xì)胞增多,而S期和 G0/ G1期細(xì)胞減少，各濃度細(xì)胞周期分布情況見表1。

2.3 NCTD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

HepG2凋亡細(xì)胞體積縮小，與正常細(xì)胞相比核質(zhì)比例增大，可見核仁或較大濃縮核小體，染色質(zhì)濃聚成塊狀和球狀沿核膜排列。

圖1 不同濃度NCTD作用HepG2細(xì)胞24、36、48 h細(xì)胞的生長抑制曲線

表1 NCTD作用24 h對HepG2細(xì)胞周期的影響

注：與a組比較,b、c、d、e組P均<0.05；與b組比較，c、d、e組P均<0.05；與c組比較,d、e組P均<0.05；與d組比較,e組P<0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)生是1個多步驟發(fā)展、多基因參與的復(fù)雜過程。從分子生物學(xué)角度看，腫瘤的發(fā)生是由于原癌基因的激活和抑癌基因的失活擾亂細(xì)胞正常增殖和凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和凋亡減少的結(jié)果[6,7]。因此，對于腫瘤的治療，一方面可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞周期，抑制其分裂增殖；另一方面可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療目的。

本實(shí)驗通過MTT法發(fā)現(xiàn)，NCTD對肝癌HepG2細(xì)胞的生長有抑制作用，各濃度組和各時間段抑制率的比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，且呈明顯的劑量-時間依賴性。惡性腫瘤的無限制增殖與細(xì)胞增殖周期的失控有關(guān)，細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞周期不同時相間存在的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)密切相關(guān)。本實(shí)驗采用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NCTD處理組HepG2細(xì)胞出現(xiàn)G2/M細(xì)胞數(shù)量增加，S期和G0/G1期細(xì)胞數(shù)量減少，提示NCTD可將細(xì)胞阻滯在G2/M期，使細(xì)胞不能進(jìn)入分裂期，從而使腫瘤細(xì)胞的體外增殖受到抑制。

細(xì)胞凋亡是由基因編碼調(diào)控的細(xì)胞主動自殺過程，既是生物體維持自身穩(wěn)定平衡的1個重要機(jī)制，也是消除異常增殖細(xì)胞的重要途徑，在腫瘤細(xì)胞的生成與丟失中起重要作用[8，9]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為近年來腫瘤治療的新靶點(diǎn)[10]。腫瘤細(xì)胞凋亡的特征及其對治療的反應(yīng)，揭示了其在腫瘤學(xué)方面的意義。腫瘤凋亡特征是核酸內(nèi)切酶活化，染色體DNA降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，產(chǎn)生亞二倍體以及細(xì)胞固縮、凋亡小體形成。應(yīng)用PI熒光染料標(biāo)記DNA，于流式細(xì)胞儀上可檢測到G1期峰前的亞二倍體峰，及凋亡峰。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測到NCTD處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后可見HepG2細(xì)胞形成的“凋亡峰”。透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡是細(xì)胞凋亡研究的經(jīng)典方法。本實(shí)驗20 μg/ml NCTD作用HepG2細(xì)胞細(xì)胞24 h后，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)呈團(tuán)塊聚集于核膜周圍，出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)一步證實(shí)了NCTD誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

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