頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體核型的檢測和分析

呂 梅，徐爾東，杜翠萍，姚藝文，翟立杰

(大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116011)

頭頸部腫瘤是國際上發(fā)病率最高的癌癥之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，其發(fā)生率位居世界第6位，在亞洲國家發(fā)生率最高，在北歐相對較低。而95%頭頸部惡性腫瘤來源于上皮層，即鱗狀細胞癌。它們主要分布于1)上呼吸道，包括鼻腔、副鼻竇、鼻咽部及喉部；2)口腔和下咽部。其他頭頸部的惡性腫瘤則主要來源于大、小涎腺[1]。由于組織病理學的一致性，人們往往一起研究及總結這些腫瘤的遺傳學規(guī)律。

有關頭頸部鱗狀上皮細胞癌的細胞遺傳學研究表明，其染色體畸變的類型不同于像血液腫瘤所表現(xiàn)的簡單、特異性、平衡性的染色體重排；主要表現(xiàn)為復雜、多倍體的、非平衡性的染色體重排，然而其畸變的規(guī)律卻是非任意性的[2]。本實驗對18個來源于頭頸部不同位置的鱗狀細胞癌細胞系進行細胞培養(yǎng)，收集分裂中期細胞，進行染色體“G”帶染色，分析核型，并與以往的研究結果進行對照總結，進一步探討頭頸部鱗狀細胞癌的染色體變異規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系(來源于鼻腔、鼻竇5例，鼻咽部3例，口腔部4例，喉部6例)由香港大學解剖教研室Sai-Wah Tsao教授贈給。

2例下鼻甲黏膜上皮(來自鼻整形病人)，1例鼻咽部黏膜上皮(來自鼻咽癌患者正常側活檢)，1例癌旁組織(來自喉癌患者)短期傳代(≤4代)細胞培養(yǎng)作為陰性對照，臨床標本均來自大連醫(yī)科大學附屬一院。

1.2 細胞培養(yǎng)

頭頸部鱗狀細胞癌細胞系在RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素和2.5 μg/mL二性霉素)中培養(yǎng)。正常對照上皮組織剪碎后，經(jīng)180 U/mL膠原酶Ⅱ，37 ℃孵育過夜；然后放入膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。其培養(yǎng)液為角化細胞培養(yǎng)液(含0.23 mg/mL的L-谷酰胺，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素，和2.5 μg/mL二性霉素)。細胞大體生長狀態(tài)是在倒置顯微鏡下觀察。

1.3 分裂中期細胞染色體“G”帶染色

培養(yǎng)細胞在收獲之前，培養(yǎng)液中加入秋水仙堿(0.01 μg/mL)作用12 h，0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化細胞脫壁。0.06 M KCl低滲處理細胞35 min，再由固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定。將3～4滴細胞懸液滴于一張浸于4 ℃水中備用載玻片上，60 ℃烘烤過夜。然后將玻片浸于2×SSC中，60 ℃作用3 h。最后賴特氏染液(BDH Burr)作用1 min 30 s。

1.4 細胞染色體核型分析

100倍光學顯微鏡下找到分裂中期細胞，拍攝分散的染色體。利用細胞遺傳學影像分析軟件(Newcatlte,UK)編排染色體，根據(jù)國際人類細胞遺傳學命名法(ISCN1995)標準描述細胞染色體核型。

2 結 果

4例對照組上皮細胞均表現(xiàn)為人正常染色體核型(圖1)。18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系核型主要表現(xiàn)為大量復雜的、不平衡性結構重排和染色體數(shù)目的改變(圖2)。但這種畸變并不是隨機的，而是有規(guī)律可循的。

2.1 染色體成分/數(shù)目的改變

與每個細胞系染色體所接近的整倍體數(shù)目比較，主要表現(xiàn)為染色體成分/數(shù)目的丟失(15例，83%)。

2.2 染色體/臂成分的失衡

染色體/臂成分的丟失主要表現(xiàn)為：2q，3p，4，8p，9p，13，14，15，17，18，21，22；染色體/臂成分的增加主要表現(xiàn)為：3q，7，8q，11q13，20 (表1)。

表1 18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體/臂成分的失衡主要表現(xiàn)Tab 1 Chromosomal imbalances in 18 cases of HNSCC cell lines

2.3 染色體斷裂點部位

大量的染色體斷裂點位于著絲粒區(qū)域,347個斷裂點中含位于中心體區(qū)域的斷裂點208個(58%)。本實驗斷裂點出現(xiàn)在著絲粒區(qū)域，即斷裂點出現(xiàn)在著絲粒帶p10和q10；或近著絲粒帶p11和q11，主要表現(xiàn)為等臂染色體形成，整條染色體臂的易位和丟失；常常涉及到的斷裂點主要有1p11-q11，3p11-q11，5p11-q11，7p11-q11，8p11-q11，14p11-q11 (表2)。

圖1 正常對照組細胞染色體為人正常有核細胞染色體核型(×1000)Fig 1 The cellular chromosomes of normal control group showed normal human chromosome karyotype(×1000)

90-101,XXXX,+X,del(X)(p11),del(1)(q31),+der(1)t(1;4)(q11;q11),der(3)t(1;3) (p13;q11) hsr(1;3)(p13;q11) ×2,-4,+6,+7,+7,+9,der(11) add(11) (q13) hsr(11)(q13),-13,-13,-14,?add(14)(q32),-18,-21,-22,mar1,mar2

圖2-1 喉鱗狀細胞癌
Fig 2-1 Laryngeal squamous cell carcinoma

71-81,XX,-Y,+2,t (2;16)(q33;q24),i(3)(q10) ×2,der(3)t(3;7)(p25;q11) ×2,-4,+ i(8)(q10) ×2,+9,+11,+dup(14)(q22q23),+15,+17,-18,+20,+21

圖2-2 舌鱗狀細胞
Fig 2-2 Glossal squamous cell carcinoma
圖2 HNSCC組具有代表性染色體畸變的核型(×1000)
Fig 2 The representative chromosomal karyotype of HNSCC cell lines(×1000)

表2 18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體著絲粒區(qū)域斷裂點Tab 2 Chromosomal breakpoints at centromeric regions in 18 cases of HNSCC cell lines

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展演變過程同時也是基因組不斷變化的積累過程。癌基因和抑癌基因是與腫瘤形成密切相關的兩類效應基因。癌基因的前體是原癌基因，原癌基因具有調控細胞正常生長和分化的能力。癌基因的激活主要是通過原癌基因的點突變、病毒插入、染色體異位及基因擴增等引起，并將導致細胞無限制的增殖。抑癌基因主要抑制細胞生長、促進細胞死亡。當抑癌基因在突變、缺失、部分或全部染色體丟失的情況下失活后，也會導致細胞的增殖[3]。因此，癌基因活化及抑癌基因失活的逐漸積累促進了腫瘤的惡性發(fā)展。而染色體增加、丟失、斷裂、重組的過程直接導致了基因組的變異。

在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細胞癌細胞內部分染色體成分擴增，部分染色體成分缺失。這實際上在基因量變上確定了癌基因的激活和擴增，抑癌基因的抑制及缺失。雖然某些機制尚不完全清楚，本文僅以以下已證實了的在頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生機制中起重要作用的基因變化，探討染色體改變、基因變異及腫瘤發(fā)生的辯證關系。

c-myc癌基因定位于染色體8q24帶?；騝-myc編碼的轉錄因子通過與生長調節(jié)因子內特異DNA序列結合而促進其表達，進而促進細胞的生長、分化。同時研究證明c-myc蛋白又可作用于端粒逆轉錄酶，促進其表達并增強其酶的活性，間接抑制細胞的衰老及死亡[4]。染色體8q增多，導致c-myc基因的擴增及其所編碼蛋白的過度表達，這對腫瘤的形成具有重要作用。大量研究報道8q增多/c-myc基因的擴增與頭頸部惡性腫瘤的轉移和復發(fā)具有明顯正相關性。

Hsr(均染區(qū))作為染色體內基因擴增的細胞遺傳學標志在本研究中多次出現(xiàn)，并且經(jīng)常定位于11q13。以往頭頸部腫瘤熒光原位雜交研究證實，許多非定位于11q13的hsr的基因序列來源于染色體11q13帶[5]。癌基因CCND1定位于11q13，CCND1作為一細胞周期調節(jié)蛋白，調節(jié)細胞周期從G1期過渡到S期[6]。過度表達CCND1可導致細胞周期G1期的縮短，縮短了基因檢測系統(tǒng)對錯誤DNA序列的修復時間，以致未修復異?；虻闹饾u積累，以及帶有錯誤基因細胞的不斷分裂和擴增。

9p染色體片段的丟失是頭頸部磷狀細胞癌最常見的遺傳學改變之一?；騊16/CDKN2A定位于9p21-22區(qū)域。CDKN2A基因編碼G1細胞周期依賴激酶(Cdks)抑制劑，其通過與Cdks蛋白結合，及抑制pRB(視網(wǎng)膜母細胞瘤)蛋白磷酸化，延長細胞周期G1期基因檢測修復階段，阻止進入S期。CDKN2A基因失活必將導致細胞檢測系統(tǒng)及細胞增殖的失調[7]。

3P的缺失是頭頸部磷狀細胞癌染色體最早期改變之一。已發(fā)現(xiàn)定位于3p的抑癌基因為FHIT基因。其基因的變異和蛋白功能的失調常發(fā)現(xiàn)于早期的頭頸部磷狀細胞癌和癌前病變的研究中[8,9]。

視網(wǎng)膜母細胞瘤基因——RB基因在調節(jié)細胞周期以及細胞分化的過程中起關鍵的作用。該基因定位于染色體的13q。低磷酸化RB蛋白作為其活化形式，與轉錄因子E2F家族蛋白結合，發(fā)揮阻止轉錄因子DNA合成和促進細胞分裂的功能。G1晚期，RB蛋白被細胞周期依賴激酶磷酸化，釋放E2F轉錄因子，促使細胞進入S期[10]。染色體13q丟失、RB基因低表達與腫瘤的高惡性度和不良預后密切相關。

本實驗研究中，染色體丟失的機率明顯高于染色體成分、數(shù)目的增加，這說明抑癌基因的功能失調在頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生機制中起相對主要的作用。

另一方面，大量的染色體斷裂點出現(xiàn)在著絲粒區(qū)域是頭頸部鱗狀細胞癌的一特殊細胞遺傳學改變。一種可能的原因是該區(qū)域的基因在染色體斷裂時所引起的活化或缺失，是頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤形成的致病因素之一。研究證明，近著絲粒區(qū)域的DNA在CpG島區(qū)的甲基化程度明顯高于其他區(qū)域的DNA。應用甲基轉移酶抑制劑5-氮胞甘可引起染色體著絲粒區(qū)域的斷裂，促進姐妹染色單體的互換、核內復制及染色體臂的易位[11]。因此，雖然染色體某些部位基因CpG島區(qū)的過度甲基化可以抑制某些抑癌基因的作用，但著絲粒區(qū)域基因的去甲基化又可促進染色體結構的不穩(wěn)定性。

頭頸部鱗狀細胞癌細胞遺傳學的研究使大家認識到，頭頸部鱗狀細胞癌染色體畸變是非任意性的，是有一定規(guī)律可循的。染色體數(shù)目、結構的不斷變異可能造成癌基因擴增、活化，抑癌基因的抑制和缺失；這種多基因改變的不斷積累貫穿著腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全部過程。對于頭頸部鱗狀細胞癌染色體畸變規(guī)律的研究和認識，將對頭頸部腫瘤的診斷、預后，以及指導臨床治療具有重要意義。

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