腺病毒及其研究進(jìn)展

陳娜娜,向冬喜,鄭叢龍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116622)

腺病毒(Adenovirus) 是從手術(shù)切除的扁桃體組織分離培養(yǎng)得到的一種DNA病毒，主要在細(xì)胞核內(nèi)繁殖，常引起人上呼吸道和眼部上皮細(xì)胞感染。腺病毒作為普通的機(jī)會(huì)性病原體長(zhǎng)期存在于人群中，免疫功能低下的病人感染腺病毒的機(jī)率較大，在居住密集的人群，如軍隊(duì)人員中可引起急性發(fā)熱性呼吸道疾病的暴發(fā)流行[1]。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)等各個(gè)學(xué)科的發(fā)展和相互滲透，腺病毒在分子水平上的應(yīng)用越來越廣泛，特別是有關(guān)腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治療和腺病毒載體的應(yīng)用已成為研究的熱點(diǎn)。因腺病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,宿主范圍廣,感染率高,易于培養(yǎng)和純化，使腺病毒作為載體的基因治療迅速發(fā)展。本文就腺病毒及其相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 腺病毒的特征

1.1 腺病毒的分類

根據(jù)宿主范圍不同，腺病毒分為哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)和禽類腺病毒屬(Aviadenovirus)。人腺病毒(Human adenoviruses,HAdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)，根據(jù)免疫學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)特性不同，將其分為 A～G 7個(gè)亞種，共有52個(gè)血清型[2],不同的血清型有不同的器官親和性并引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。

1.2 腺病毒的結(jié)構(gòu)

腺病毒呈無囊膜的球形結(jié)構(gòu),其病毒粒子在感染的細(xì)胞核內(nèi)常呈晶格狀排列，每個(gè)病毒顆粒包含一個(gè)36 kb的線性雙鏈DNA，兩端各有一個(gè)100～600 bp的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat,ITR),ITR的內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)，是病毒包裝所需要的順式作用元件?；蚪M包含早期表達(dá)的與腺病毒復(fù)制相關(guān)的E1～E4基因和晚期表達(dá)的與腺病毒顆粒組裝相關(guān)的L1～L5基因。線狀雙股DNA與核心蛋白形成直徑為60～65 nm的髓芯,被包裹于衣殼內(nèi)。衣殼呈二十面體對(duì)稱，由252個(gè)直徑8～10 nm的殼粒組成,殼粒排列在三角形的面上,每邊6個(gè),其中240個(gè)為六鄰體(非頂點(diǎn)殼粒) ,另12個(gè)為五鄰體基底(頂點(diǎn)殼粒)。每個(gè)六鄰體是六鄰體蛋白的同源三聚體,三聚體的六鄰體分子有一個(gè)三角形的塔尖和五面體的基底,塔區(qū)由4個(gè)環(huán)構(gòu)成即loop1、loop2、loop3、loop4，基底包含兩個(gè)區(qū)域P1、P2區(qū)[3]。六鄰體上的表位(epitope)是診斷不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)，它包括哺乳動(dòng)物腺病毒屬的抗原成分，是病毒體對(duì)免疫選擇壓力最敏感的部位。每個(gè)五鄰體基底上結(jié)合著1根(哺乳動(dòng)物腺病毒)或2根(禽腺病毒)長(zhǎng)9～77.5 nm的纖維突起,這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼面伸出,纖維頂端形成頭節(jié)區(qū)，纖突有血清特異性，且含有負(fù)責(zé)體外血細(xì)胞凝集的種屬特異性抗原決定位點(diǎn)。

1.3 腺病毒受體

腺病毒除B和D亞種外，其它亞種的受體都是柯薩奇-腺病毒受體[4]?？滤_奇-腺病毒受體(Coxsackic-adenovirus receptor,CAR)又稱為Hela細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，是柯薩奇病毒與腺病毒的特異性受體,其本質(zhì)是一種細(xì)胞間黏附分子,在上皮細(xì)胞的緊密連接和細(xì)胞間相互連接處表達(dá),CAR是相對(duì)分子量為46000的跨膜糖蛋白,該蛋白貫通細(xì)胞膜,分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。CAR表達(dá)水平在介導(dǎo)腺病毒感染方面起著重要作用,其表達(dá)在體內(nèi)是可調(diào)節(jié)的,具有階段依賴性，CAR受體表達(dá)越高,提示組織器官越容易感染。B亞種中大多數(shù)可與胞膜表面免疫調(diào)節(jié)分子CD46相結(jié)合，但ADV3和ADV7分別與相關(guān)免疫分子CD80或CD86結(jié)合。D亞種可與細(xì)胞表面普遍存在的唾液酸受體結(jié)合[5]。另一種參與腺病毒感染細(xì)胞的介質(zhì)是細(xì)胞表面的第二受體整合素，包括αγβ3和αγβ5，它與五鄰體的基底部相結(jié)合[6]，整合素在細(xì)胞表面的表達(dá)水平高低,也影響了腺病毒的感染效率。

2 腺病毒的感染與致病性

2.1 腺病毒的感染

2.1.1 腺病毒引起感染的類型：腺病毒侵入宿主細(xì)胞后至少能引起3種感染:①慢性、潛伏性感染:常在淋巴細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，潛伏感染時(shí)外放的病毒量極少,細(xì)胞壞死也不明顯,故臨床上感染不明顯,潛伏感染的機(jī)制尚不清楚。②溶解性感染:病毒在細(xì)胞內(nèi)如人類上皮細(xì)胞中經(jīng)歷復(fù)制過程,通過溶解細(xì)胞作用使細(xì)胞死亡。③腫瘤樣變異：此時(shí)病毒繁殖只進(jìn)行最初幾步,然后腺病毒DNA與細(xì)胞DNA整合并復(fù)制,但不產(chǎn)生感染性病毒,腺病毒抗原性較穩(wěn)定。

2.1.2 腺病毒流行病學(xué)：腺病毒可通過人、水、媒介物和器械傳播，室溫條件下，腺病毒在污物中存在周期可延長(zhǎng)至3周。腺病毒在兒童和軍營(yíng)人員中更易發(fā)生感染和大規(guī)模流行，大多數(shù)嬰幼兒在出生后的5年內(nèi)至少感染過1種腺病毒株[7]。在過去的幾年中，腺病毒作為主要的病原體在免疫功能低下宿主如艾滋病人、免疫遺傳缺陷的患者、骨髓接受者、固體器官和造血干細(xì)胞移植者常引起高發(fā)病率和死亡率；兒科經(jīng)受同種型干細(xì)胞移植的病人，其感染腺病毒后死亡率可高達(dá)60%[8]。一些致命的感染常由腺病毒血清型1、2、3引起，在這些病人體內(nèi)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌、真菌等微生物共感染的情況。艾滋病人感染腺病毒會(huì)產(chǎn)生肺炎、肝炎、腦膜軟化、腎炎、胃腸炎等并發(fā)癥。

2.2 腺病毒的致病性

2.2.1 腺病毒所致疾病：腺病毒是無包膜病毒，在低pH值環(huán)境下可穩(wěn)定存在，有很強(qiáng)的耐物理和化學(xué)試劑的作用，腺病毒可對(duì)胃腸分泌物和膽汁產(chǎn)生耐受，因此腺病毒可在胃腸內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生很高的病毒載量。腺病毒常在咽、結(jié)膜、腸道及淋巴組織內(nèi)繁殖，并導(dǎo)致各種各樣的臨床癥狀，比如呼吸系統(tǒng)的感染、結(jié)膜炎、胃腸炎、肝炎、出血性膀胱炎、神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂等。不同的腺病毒亞種會(huì)引起不同的疾病，如人腺病毒C亞種主要引起小兒科的上呼吸道感染,人腺病毒B亞種常在成年人中引起流行，人腺病毒B和E亞種是軍營(yíng)人員感染的主要病因,人腺病毒F亞種會(huì)引起感染性腹瀉[9]。腺病毒在有免疫力的宿主體內(nèi)感染是溫和的,而且具有自限性。

2.2.2 腺病毒致病機(jī)理：對(duì)腺病毒感染宿主細(xì)胞后引起疾病的致病機(jī)制尚不清楚，可能通過以下機(jī)制來逃避宿主的免疫應(yīng)答：①通過與MHC-I類分子結(jié)合形成復(fù)合物來抑制末端氨基酸的糖基化或通過阻斷MHC-I類分子的轉(zhuǎn)錄或mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)而阻止細(xì)胞表面MHC-I類分子受體的表達(dá)。②通過與病毒相關(guān)的RNA和E1A來抑制干擾素對(duì)腺病毒的作用。③腺病毒E1B基因編碼的蛋白可能通過與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成異源復(fù)合物來抑制感染細(xì)胞的內(nèi)在凋亡。

在腺病毒持續(xù)感染過程中，蛋白14.7 kDa和gp19起重要作用，14.7 kDa蛋白與控制宿主免疫反應(yīng)有關(guān)，可以阻斷腫瘤壞死因子介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用；gp19阻止MHC-I類分子轉(zhuǎn)運(yùn)到感染的細(xì)胞表面，減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞的攻擊[10]。腺病毒通過感染樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)產(chǎn)生早期和晚期抗原來改變細(xì)胞表面標(biāo)志，腺病毒還可通過感染單核細(xì)胞來抑制其分化為DC，從而逃避T細(xì)胞的識(shí)別[11]。在腺病毒急性感染恢復(fù)當(dāng)中，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是很重要的，T細(xì)胞功能低下的病人感染腺病毒的幾率非常高。Mistchenko等[12]研究顯示，TNF-α、IL-6、IFN-γ在致命的腺病毒感染的兒童血清中含量高，而在輕度腺病毒感染者體內(nèi)存在水平很低。體液免疫在腺病毒感染的免疫應(yīng)答中亦起重要作用，有腺病毒血癥的HSCT(造血干細(xì)胞移植)接受者，在免疫應(yīng)答清除病毒的過程中會(huì)產(chǎn)生高水平的血清特異性抗體[13]。

3 腺病毒的檢測(cè)方法

對(duì)腺病毒的檢測(cè)依賴于疾病的類型和所獲取的標(biāo)本，確診腺病毒的存在可采用病毒的細(xì)胞培養(yǎng)、抗原測(cè)定和基因組檢測(cè)等技術(shù)。

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常用A549、Hep-2和Hela細(xì)胞來培養(yǎng)臨床標(biāo)本中的腺病毒。除血清型40和41外，其它腺病毒血清型在人上皮細(xì)胞系上生長(zhǎng)良好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞圓縮,出現(xiàn)核內(nèi)包涵體聚集成串等病變現(xiàn)象，細(xì)胞病變2～7 d可見，可持續(xù)到28 d。盡管細(xì)胞培養(yǎng)仍然是金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)臨床標(biāo)本仍是不敏感，且比較慢，易受細(xì)菌和真菌的污染。

3.2 抗原檢測(cè)

常用來直接檢測(cè)腺病毒在呼吸道和胃腸道的感染，較快速且靈敏度較高。免疫熒光(尤其對(duì)呼吸道標(biāo)本、咽拭子和活組織標(biāo)本)和酶免疫分析(尤其對(duì)于糞便標(biāo)本)是常用的方法，與細(xì)胞培養(yǎng)相比，免疫熒光所測(cè)腺病毒的靈敏性能提高40%～60%[14]，其它直接測(cè)定抗原的方法包括免疫層析法和乳膠凝集法。研究證實(shí)，與細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)方法相比，使用免疫層析試劑盒所測(cè)定的靈敏度可達(dá)90%[15]。

3.3 電子顯微鏡

腺病毒的形態(tài)學(xué)特征決定其可用電子顯微鏡進(jìn)行鑒別，但這種方法主要在一些機(jī)構(gòu)使用，依據(jù)糞便中存在的病毒顆粒(大約106～108個(gè)/mL)，常用來診斷急性胃腸炎。

3.4 組織病理學(xué)

依據(jù)肺的組織病理學(xué)特征可對(duì)腺病毒引起的肺炎加以鑒別，肺的組織病理學(xué)特征包括彌散性肺炎、支氣管上皮細(xì)胞的壞死、單核細(xì)胞侵潤(rùn)的毛細(xì)支氣管炎和透明膜的形成等，通過原位雜交、免疫組化和PCR可進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

3.5 分子生物學(xué)

用來檢測(cè)腺病毒基因組很靈敏，當(dāng)病人體內(nèi)病毒載量較低或需要快速的檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)更為適用。最近幾年分子生物學(xué)的方法在臨床運(yùn)用越來越多,常選擇與六鄰體基因、纖突基因或病毒相關(guān)的RNA I和II作為PCR引物，PCR方法包括常規(guī)的PCR、Real Time-PCR，常規(guī)的PCR是一種定量分析的方法，需要1～2 d的時(shí)間，而Real Time-PCR可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)定量分析出結(jié)果。Lawrence等[16]應(yīng)用的PCR和電噴霧電離質(zhì)譜法相結(jié)合技術(shù)可對(duì)人腺病毒的血清型進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定。

3.6 序列測(cè)定

德國(guó)Madischiw等[17]結(jié)合了普通PCR或者定量PCR與測(cè)序相結(jié)合技術(shù),發(fā)明了一種兩步診斷法。測(cè)序是對(duì)核酸序列最全面、直觀的反映。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,測(cè)序速度得到了質(zhì)的提升。因此，未來將測(cè)序應(yīng)用于診斷也是一種趨勢(shì)。

4 抗腺病毒治療

藥物抗腺病毒機(jī)制可能有以下幾種：①藥物與腺病毒表面特定部位結(jié)合，在病毒吸附細(xì)胞的過程中，藥物可能會(huì)破壞腺病毒的纖突,阻止了病毒的吸附,使病毒不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。②藥物與細(xì)胞表面受體結(jié)合，改變細(xì)胞構(gòu)象，使對(duì)腺病毒敏感的細(xì)胞變?yōu)榉敲舾屑?xì)胞，從而改變細(xì)胞膜上病毒的數(shù)量和結(jié)構(gòu)來控制病毒的感染。③藥物的某些成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)基因的代謝和表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，從而抑制病毒核酸復(fù)制或阻止病毒蛋白合成。

目前,沒有正式的藥物用于抗腺病毒感染的治療，只有幾種抗病毒藥物如更昔洛韋，阿糖腺苷，病毒唑，西多福韋等用于一些病例和群體的研究[18]。楚建平等[19]通過體外試驗(yàn)初步觀察到，更昔洛韋雖然不能直接滅活A(yù)dV3和阻止AdV3吸附至敏感細(xì)胞,但它具有抑制AdV3復(fù)制的作用,其作用明顯優(yōu)于病毒唑。病毒唑是一種嘌呤核苷酸類似物，在體外能抑制DNA和RNA病毒，其作用機(jī)制可能是抑制RNA的加帽活動(dòng)或直接抑制病毒多聚酶的作用或增加新合成DNA的基因突變[20]，其副作用主要是引起溫和可逆的鐮狀細(xì)胞貧血,利用病毒唑治療處于傳播腺病毒高發(fā)期的病人，效果不明顯。西多福韋是新型的胞嘧啶核苷膦?；酌蜒苌?，是一種廣譜抗病毒藥物，在體外能抑制幾種DNA病毒的復(fù)制，在感染的細(xì)胞內(nèi)通過形成二磷酸核苷類似物,與正常的核苷競(jìng)爭(zhēng)性整合入病毒DNA,最終導(dǎo)致核酸鏈的延伸終止。盡管其有腎毒性、骨髓抑制、眼色素膜炎等副作用，但西多福韋快速治療腺病毒感染成功的幾率很高[21]。

5 腺病毒作為載體的應(yīng)用前景

5.1 腺病毒載體的特性

腺病毒載體是黏膜免疫的理想載體，經(jīng)口、鼻、氣管等黏膜表面接種,可獲得包括黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫在內(nèi)的全面免疫。腺病毒載體易于操作構(gòu)建，能有效地將外源基因轉(zhuǎn)染到各種靶細(xì)胞或組織中，且能高效表達(dá)外源基因，尤其是以腺病毒為載體構(gòu)建的重組活疫苗在進(jìn)行癌癥、遺傳病和重要傳染病的基因治療等方面的研究應(yīng)用最為熱門。

5.2 腺病毒載體優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

腺病毒載體生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、制備純化相對(duì)容易、產(chǎn)毒滴度高、外源基因容量大(7～8 kb)，腺病毒載體攜帶的外源基因獨(dú)立于靶細(xì)胞染色體之外表達(dá)，無插入突變激活癌基因的危險(xiǎn)，這使得腺病毒成為表達(dá)和傳遞治療基因的主要候選者[22]。由于腺病毒載體可以實(shí)現(xiàn)治療基因短暫的高表達(dá)，因此它在癌癥基因治療中具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，涉及腺病毒基因轉(zhuǎn)移的腫瘤治療方案有很多，如利用病毒或非病毒載體向機(jī)體導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)蛋白及腫瘤特異性抗原來誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫,以達(dá)到限制腫瘤生長(zhǎng),促使腫瘤消退的目的。腺病毒載體還被用于轉(zhuǎn)移IL-2、GM-CSF等細(xì)胞因子和p53等抑癌基因，治療的腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，頭頸部腫瘤等[23]。腺病毒載體能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，因此被用作疫苗載體。Susan等[24]研究發(fā)現(xiàn),L4-22K 和L4 - 33K作為啟動(dòng)子來控制HAd5V的晚期階段的感染，這為腺病毒載體的應(yīng)用提供了新的表達(dá)模式，重組的腺病毒載體HAd5V(Human Adenovirus 5)為激活淋巴細(xì)胞抗腫瘤和抗病毒作用提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。不足的是，一些優(yōu)先暴露感染HAdV的受試者，在接種HIV-HAd5V載體構(gòu)建的疫苗后，會(huì)增加對(duì)HIV的易感性[25]，同時(shí)由于對(duì)AdV5有免疫力人群的普遍存在，可能會(huì)限制腺病毒載體的應(yīng)用[26]。Shaoning Jiang等[27]研究顯示，重組腺病毒載體會(huì)減弱肝臟上胰島素信號(hào)分子的表達(dá)，最終導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝的改變，因此在應(yīng)用腺病毒載體進(jìn)行基因治療和研究時(shí)應(yīng)予以考慮。針對(duì)腺病毒載體存在的表達(dá)時(shí)間短、免疫原性強(qiáng)，易引起炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)毒性等特點(diǎn),最新研究的復(fù)制型腺病毒載體、低抗原性腺病毒載體和靶向腺病毒載體具有良好的應(yīng)用前景。

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