結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白GroEL1的研究進(jìn)展

何磊，張鷺，彭超，王洪海

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

各種生物有機(jī)體，從低等的大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅(Drosophilamelanogaster)到高等的植物、哺乳動(dòng)物，在受周圍環(huán)境不利因素影響下，會(huì)通過(guò)快速、短暫的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)生一系列適應(yīng)性改變，在此期間細(xì)胞內(nèi)一些正?；虻谋磉_(dá)受抑制，某些特殊基因被激活，表現(xiàn)為暫時(shí)性下調(diào)或選擇性上調(diào)表達(dá)一組蛋白，這一現(xiàn)象稱為熱休克反應(yīng)。該反應(yīng)本質(zhì)上是細(xì)胞對(duì)外界作出的一種自身保護(hù)性反應(yīng)，所產(chǎn)生的蛋白就是熱休克蛋白(heat shock protein， HSP)。HSP是一種高度保守且廣泛表達(dá)的蛋白，最早在高溫培養(yǎng)果蠅時(shí)發(fā)現(xiàn)。正常情況下，HSP作為新生蛋白、非正常折疊蛋白和突變蛋白的分子伴侶，阻止蛋白質(zhì)變性和聚集，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)分泌，并參與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)激刺激的自我保護(hù)[1]。

HSP按相對(duì)分子質(zhì)量大小可分為不同家族，主要?jiǎng)澐譃榉核?( ubiqutin )、HSP20、HSP60、HSP70、HSP90及大分子HSP家族。其中HSP60 和 HSP70 作為HSP的2個(gè)重要家族，具有高度的物種保守性，但不同家族的HSP無(wú)明顯序列同源性。HSP70已被深入研究，而 HSP60 的研究相對(duì)較少。HSP60在核酸序列及蛋白質(zhì)組成上具有高度的保守性。不同生物間HSP60具有50%～90%同源性。原核生物中 HSP60 類似物是大腸埃希菌的伴侶蛋白 GroEL。GroEL伴侶分子在生物體內(nèi)幫助折疊10%～15%細(xì)胞內(nèi)蛋白[2,3]。雖然在大部分細(xì)菌中只有1組GroEL基因，但結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)基因組攜帶2組groEL基因，即groEL1和groEL2，分別編碼GroEL1(Hsp60、Cpn60.1)和 GroEL2 (Hsp65、Cpn60.2)蛋白。結(jié)核分枝桿菌GroEL1和GroEL2具有61%同源性，與大腸埃希菌分別有53%和59%同源性，與人Hsp60也有47%同源性[4]。

結(jié)核分枝桿菌中GroEL2具有20多個(gè) T細(xì)胞抗原決定簇，其中1個(gè)是結(jié)核分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)特異性的，具有很好的免疫保護(hù)與免疫治療作用[5]，是機(jī)體對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌入侵的重要免疫保護(hù)性抗原之一，為細(xì)胞生存所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠化學(xué)治療后接種groEL2 DNA，能清除殘余細(xì)菌，提示GroEL2不僅可作為預(yù)防性疫苗的候選組分，也可作為治療性疫苗的候選組分[6,7]。

GroEL1蛋白不是細(xì)胞生存所必需的，而是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)抗原。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后會(huì)產(chǎn)生針對(duì)GroEL1的交叉免疫反應(yīng)，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身免疫性疾病。有研究顯示，GroEL1比GroEL2具有更強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，使人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，但不能刺激產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子γ干擾素(interferon γ，IFN γ)和 IL-4[8]。這種分子伴侶和免疫優(yōu)勢(shì)抗原的雙重功能，以及在自身免疫性疾病中的作用，使得GroEL1越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。

1 結(jié)核分枝桿菌GroEL1的發(fā)現(xiàn)

GroEL也稱HSP60，是典型的分子伴侶。人們對(duì)分子伴侶及其在蛋白折疊中功能的了解來(lái)自于對(duì)這種蛋白及其共伴侶分子HSP10(在原核生物中為GroES)的研究。GroES稱為輔分子伴侶(co-chaperonin)，因?yàn)镚roEL在指導(dǎo)折疊過(guò)程中起重要作用，而GroES 輔助其活性功能。

在大腸埃希菌中，由于GroEL/GroES伴侶系統(tǒng)對(duì)至少13種重要蛋白的折疊是必需的，所以這些寡聚體蛋白對(duì)生長(zhǎng)極其重要(GroEL是四聚體，GroES是七聚體)[9]。大部分細(xì)菌在單個(gè)操縱子中只有1份groES和groEL基因拷貝[10]。然而，基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，大約15%的細(xì)菌擁有不止1份groEL基因，這些細(xì)菌主要是放線菌，結(jié)核分枝桿菌也屬此類。GroEL2在很久前就因其強(qiáng)免疫原性而被關(guān)注，被稱之為普遍抗原[11]。1993年，Kong等發(fā)現(xiàn)一個(gè)同源基因，命名為groEL1[12]。結(jié)核分枝桿菌中g(shù)roEL1基因位于groES基因下游，表明它編碼這種生物主要的60kD蛋白(圖1)。

groES, codes for the Cpn10 antigen (HSP10);groEL1, codes for the Cpn60.1 antigen (HSP60);groEL2, codes for the Cpn60.2 antigen (HSP65).

圖1groES-groEL1順式操縱子和groEL2基因在基因組上的結(jié)構(gòu)[13]

Fig.1GenomicorganizationofthegroES-groEL1operonandthegroEL2gene

2 結(jié)核分枝桿菌 GroEL1獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌GroEL結(jié)構(gòu)的測(cè)定，研究者發(fā)現(xiàn)GroEL以二聚體形式存在[14]。每個(gè)亞單位由頂部(apical domain)、赤道部(equatorial domain)和中間部(intermediate domain)3個(gè)區(qū)域組成。GroEL A鏈由447個(gè)氨基酸殘基組成，B鏈由445個(gè)殘基組成，擁有與大腸埃希菌相似的折疊。在GroEL表面存在疏水區(qū)。GroEL1的面積比GroEL2大，赤道部出現(xiàn)一個(gè)疏水區(qū)與N端殘基電子密度有關(guān)。巧妙的構(gòu)象變化影響不對(duì)稱單位中所有分子N端殘基螺旋的方向，可保護(hù)赤道區(qū)的疏水殘基[14]。

結(jié)核分枝桿菌GroEL的2個(gè)蛋白具有如下特點(diǎn)：低序列性的寡聚體形式而非四聚體，非常弱的ATP酶活性，在底物折疊方面非常弱的活性[15]。因此，人們開(kāi)始懷疑GroEL的2個(gè)蛋白是否具有助折疊功能，質(zhì)疑被感染宿主中結(jié)核分枝桿菌GroEL蛋白生物功能的本質(zhì)[16]。

3 結(jié)核分枝桿菌GroEL1的功能

3.1 分子伴侶功能

許多分子伴侶是HSP家族的成員。分子伴侶通過(guò)結(jié)合和釋放的方式來(lái)識(shí)別非天然狀態(tài)的蛋白，幫助變性、不可溶的凝聚蛋白正確折疊，重新恢復(fù)天然構(gòu)象, 從而提高細(xì)胞的應(yīng)急耐受能力[17]。groEL1和groES編碼基因共同排列于groESL操縱子上，而groEL2單獨(dú)排列于染色體上。所有分枝桿菌的GroEL在熱休克、氧化應(yīng)激反應(yīng)、巨噬細(xì)胞感染時(shí)大量表達(dá)，比平時(shí)增加1%～10%[18-20]。

一般的細(xì)菌如大腸埃希菌在行使分子伴侶功能時(shí)均需要結(jié)合其輔助蛋白GroES和水解ATP供能。分枝桿菌卻不需要輔助蛋白和ATP的協(xié)助即能完成蛋白質(zhì)重新折疊、組裝及轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)赤道部疏水區(qū)結(jié)合未折疊的蛋白，防止錯(cuò)誤折疊和聚集。輔助蛋白折疊需要耗能而使細(xì)菌新陳代謝緩慢，結(jié)核分枝桿菌改變了以往蛋白質(zhì)折疊需要耗能的途徑，將ATP提供給更需要的環(huán)節(jié)。在檸檬酸合成酶體外折疊的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，GroEL具有促進(jìn)其重新折疊的能力，且這種能力不受輔助蛋白和ATP的影響[21]。

3.2 抗原

對(duì)致死率很高的結(jié)核病而言，GroEL1可作為一種接種抗原使用，并有望成為治療結(jié)核病的一種特效藥。GroEL1作為一種免疫刺激物，能刺激機(jī)體產(chǎn)生一定效價(jià)的抗體。通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定所得蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果表明，在分別被牛型結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌感染后，眾多HSP(包括GroEL1)在宿主巨噬細(xì)胞中表達(dá)量增加。已確認(rèn)HSP有細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性[22,23]，可能促成這種免疫原性在感染宿主中高表達(dá)，不同種類HSP高度的序列同源性也導(dǎo)致它們之間存在交叉反應(yīng)的抗原表位，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。免疫系統(tǒng)一旦接觸特殊病原體的HSP，便可引起免疫記憶，誘導(dǎo)與其他生物體包括宿主HSP的交叉反應(yīng)，當(dāng)免疫系統(tǒng)再次感染時(shí)可啟動(dòng)快速應(yīng)答。在人和小鼠模型中，GroEL1是體液和T細(xì)胞應(yīng)答的靶點(diǎn)[24]。在結(jié)核病、麻風(fēng)病患者和感染結(jié)核的小鼠體內(nèi)可檢測(cè)到GroEL1特異性抗體[25,26]。大約20%分枝桿菌反應(yīng)性CD4+αβT細(xì)胞能識(shí)別結(jié)核分枝桿菌GroEL1[27]。

3.3 在抗原呈遞中的作用

除直接的抗原作用，HSP對(duì)免疫系統(tǒng)還有間接作用。體內(nèi)病原體的傳染過(guò)程會(huì)經(jīng)過(guò)一次熱休克反應(yīng)，引起HSP含量增加，這些HSP被加工和作為外源因子可結(jié)合大量細(xì)胞內(nèi)蛋白降解產(chǎn)生的肽。GroEL 作為HSP的一員，也會(huì)與這些肽段結(jié)合，從而形成GroEL-肽復(fù)合物。這些復(fù)合物被抗原呈遞細(xì)胞加工處理之后，肽段被傳遞到主要組織相容性復(fù)合物 (major histocompatibility complex，MHC)編碼的Ⅰ類或Ⅱ類分子，隨后這些MHC 多肽復(fù)合物被 T細(xì)胞識(shí)別。CD4(輔助性T細(xì)胞)和CD8(殺傷性T 細(xì)胞)等多種不同類型的 T 細(xì)胞識(shí)別HSP決定簇，有利于病原體清除[28]。

新近研究顯示，用結(jié)核分枝桿菌GroEL1轉(zhuǎn)染腫瘤小鼠，可減少致腫瘤性細(xì)胞。GroEL1有呈遞腫瘤免疫顯性抗原到細(xì)胞表面的作用[29]，顯示HSP有呈遞和攜帶抗原的能力。

4 新功能的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展

4.1 蛋白伴侶分子

結(jié)核分枝桿菌中GroEL2是細(xì)胞生存所必需的，但無(wú)論是在肉湯培養(yǎng)基還是巨噬細(xì)胞中，groEL1突變體與野生型菌株都沒(méi)有區(qū)別，表明GroEL1對(duì)細(xì)胞生存是非必需的。但鼠感染研究表明，無(wú)論是在小鼠還是豚鼠中，groEL1突變體都不能產(chǎn)生肉芽腫炎癥，這與groEL1突變引起細(xì)胞因子表達(dá)減少有關(guān)[30]。因此，GroEL1可能是結(jié)核分枝桿菌感染中控制細(xì)胞因子依賴性肉芽腫產(chǎn)生的關(guān)鍵因子。也就是說(shuō)，GroEL1激活原發(fā)性感染的細(xì)胞因子產(chǎn)物，維持感染的疾病狀態(tài)。然而，這種免疫調(diào)控功能是否代表分枝桿菌屬中GroEL1的主要作用仍懸而未決，因?yàn)檫@種蛋白也存在于非典型性分枝桿菌如恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)或非致病性物種中。

在條件致病性物種如恥垢分枝桿菌中，groEL1包含了整合噬菌體Bxb1的attB位點(diǎn)[31]，而且對(duì)于正常的浮游生長(zhǎng)不可或缺。也有研究指出，GroEL1在恥垢分枝桿菌生物膜形成方面的作用：通過(guò)整合噬菌體Bxb1，恥垢分枝桿菌的groEL1基因失活，細(xì)菌呈現(xiàn)正常的浮游生長(zhǎng)，但不形成成熟的生物膜。研究表明，GroEL1在KasA蛋白(一種參與分枝菌酸合成的Ⅱ型脂肪酸合成酶的關(guān)鍵成分)的幫助下，特別是在生物膜形成過(guò)程中，調(diào)控分枝菌酸-分枝桿菌細(xì)胞壁長(zhǎng)鏈脂肪酸成分的合成[16]。雖然結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的GroEL1直系同源物，顯示高度的保守序列，但功能卻不相似。很可能分枝桿菌GroEL蛋白序列或者結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化對(duì)其生物學(xué)活性產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，或者蛋白可能經(jīng)歷了不同的翻譯后修飾。

最近研究表明，GroEL1保守蛋白的磷酸化是物種特異性的。在結(jié)核分枝桿菌中，GroEL1是一種Ser/Thr 蛋白激酶的底物，可以在Thr25和Thr54位點(diǎn)磷酸化，其中Thr25是關(guān)鍵的磷酸化接受位點(diǎn)。環(huán)境信號(hào)可引發(fā)GroEL1磷酸化，并可能影響其生物活性。Thr25磷酸化也許是導(dǎo)致病原體和非病原體物種GroEL1功能不同的原因。要證實(shí)Thr25磷酸化與誘導(dǎo)感染動(dòng)物炎癥反應(yīng)的聯(lián)系，需擁有GroEL1(T25A)等位基因的結(jié)核分枝桿菌同源菌株[32]。

相反，恥垢分枝桿菌中GroEL1不是Ser/Thr蛋白激酶F(serine/threonine protein kinase F, PknF)的底物。GroEL1通過(guò)物理性結(jié)合KasA和SMEG4308，完成主要的翻譯后修飾[16]。恥垢分枝桿菌中GroEL1(T25A)不同的磷酸化模式是否與KasA相互作用，繼而影響成熟生物膜形成，有待證實(shí)[32]。

GroEL1蛋白的不同表現(xiàn)表明這些分子并不是統(tǒng)一的，不同來(lái)源的GroEL1蛋白可以表達(dá)不同的生物活性。

4.2 DNA伴侶分子

研究表明，結(jié)核分枝桿菌GroEL1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中，獲得一種新功能，即以低特異性、高DNA親和力來(lái)結(jié)合DNA的能力，從而成為核酸相關(guān)蛋白(nucleoid-associated protein，NAP)的一員。GroEL1可有效保護(hù)DNA免受DNase Ⅰ和氫氧自由基的損害。原子粒顯微鏡研究表明，GroEL1可將一條大的DNA濃縮為一個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)DNA雜交和免疫熒光圖像發(fā)現(xiàn)純核酸中存在GroEL1時(shí)兩者會(huì)發(fā)生相互作用，說(shuō)明自然環(huán)境中GroEL1和DNA可相互作用[33]。

產(chǎn)生這一功能的原因可能在于GroEL1底物識(shí)別頂端區(qū)域的改變導(dǎo)致底物特異性從多肽轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪塑账?。根?jù)其二聚體而非四聚體的結(jié)構(gòu)，推測(cè)這種蛋白寡聚狀態(tài)的改變可能來(lái)自于細(xì)微突變，具體原因未知[34]。

5 結(jié)語(yǔ)

分枝桿菌GroEL1作為基因復(fù)制的產(chǎn)物，不僅具有原始的助蛋白折疊功能，還可作為一種重要抗原被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，在結(jié)核病的防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且在不同分枝桿菌中呈現(xiàn)出多種不同的生物學(xué)功能。結(jié)核分枝桿菌的GroEL1作為蛋白分子伴侶，幫助控制細(xì)胞因子依賴性肉芽腫的形成[35]；在恥垢分枝桿菌中，GroEL1作為蛋白分子伴侶，與分枝菌酸的生物合成有關(guān)。這對(duì)結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)尤其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存有重要意義，基因敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。GroEL1包含了整合噬菌體Bxb1的attB位點(diǎn)，對(duì)于恥垢分枝桿菌正常的浮游生長(zhǎng)是不可或缺的，且其C端富含組氨酸殘基，對(duì)生物膜形成很重要。研究還發(fā)現(xiàn)它具有 DNA 分子伴侶功能，可保護(hù)DNA免受自由基侵害。GroEL蛋白序列或者結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化對(duì)其功能可能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，致使不同來(lái)源的GroEL1蛋白表達(dá)不同的生物活性[33]。

未來(lái)的研究將對(duì)致病菌和條件致病菌GroEL蛋白的不同功能進(jìn)行分析，找出產(chǎn)生這些差異的具體原因，從而有助于找到合適的藥物靶點(diǎn)和(或)疫苗，為人類結(jié)核病的發(fā)生及進(jìn)化機(jī)制的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和廣闊的視角。另外，致病菌GroEL1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了新的功能，這種功能變化的具體原因也有待繼續(xù)研究。

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