上海部分地區(qū)兒童艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的臨床分析

馮云,王傳清,金嘉琳,張文宏

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院細(xì)菌室，上海 201102

艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea，CDAD)是指糞便艱難梭菌毒素檢測(cè)陽(yáng)性、有腹瀉或血便等臨床癥狀的疾病[1]。20世紀(jì)末，艱難梭菌感染率在美國(guó)仍然保持平穩(wěn)狀態(tài)(每10萬(wàn)人中30～40例)；但21世紀(jì)初以來(lái)，感染率迅速上升(至2005年每10萬(wàn)人中84例)，尤其是嚴(yán)重感染者急劇增加。加拿大2003年艱難梭菌感染率較以前增長(zhǎng)了3倍多，且病死率高達(dá)6.9%[2]。美國(guó)得克薩斯州2005年CDAD死亡例數(shù)是1999年的6倍，醫(yī)院內(nèi)CDAD相關(guān)死亡例數(shù)增加了4.5倍，護(hù)理院則增加了7倍[3]。而美國(guó)2001～2006年對(duì)住院兒童CDAD監(jiān)測(cè)顯示其發(fā)病率也顯著升高[4]。艱難梭菌可造成一系列疾病，從自限性腹瀉到危及生命的敗血癥、結(jié)腸穿孔、中毒性巨結(jié)腸等[5]，嚴(yán)重感染者的結(jié)局可能是腸道切除，甚至死亡[2]。但我國(guó)對(duì)CDAD的研究較少，近年來(lái)無(wú)明確的感染率數(shù)據(jù)[6]。復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院曾在腹瀉患者中進(jìn)行了1年的CDAD監(jiān)測(cè)，但未發(fā)現(xiàn)高毒力艱難梭菌菌株的存在[7]。發(fā)生CDAD的危險(xiǎn)人群主要是長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素者，尤其是年老、體弱的住院患者，兒童并不是艱難梭菌感染的危險(xiǎn)人群。但最近數(shù)據(jù)顯示，兒童及無(wú)抗生素應(yīng)用史者中CDAD病例數(shù)開(kāi)始增多[8,9]。為了解我國(guó)腹瀉患兒中艱難梭菌的感染情況，本文對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院2007年2～9月腹瀉患兒的糞便標(biāo)本進(jìn)行了艱難梭菌腸道感染的監(jiān)測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

納入標(biāo)準(zhǔn)：有腹瀉或血便癥狀、留取標(biāo)本前30 d內(nèi)有抗生素使用史、年齡<14歲患兒的糞便樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：確診其他病原體引起的腹瀉。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，共入選111例。

1.2 方法

1.2.1送檢標(biāo)本的糞常規(guī)鏡檢用基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的VIDAS CDA2試劑盒(bioMerieux S.A.，法國(guó))檢測(cè)糞便艱難梭菌毒素A，并做艱難梭菌糞便厭氧培養(yǎng)。所有患兒基本情況見(jiàn)表1。

表1病例基本情況

Tab.1Basicinformationoftherecruitedcases

Basic informationMedian (range)Age9 months (2 d-14 years old)Diarrhea duration6 d (1 d-2 years old)Gender (female/male)45/66

1.2.2分組將入院前2 d內(nèi)發(fā)生腹瀉的患兒分入院外腹瀉組，將入院2 d后發(fā)生腹瀉的患兒分入院內(nèi)腹瀉組；將腹瀉病程2周以?xún)?nèi)定義為急性腹瀉，2周～2個(gè)月定義為遷延性腹瀉，2個(gè)月以上定義為慢性腹瀉。比較院外腹瀉組與院內(nèi)腹瀉組的急性、遷延性、慢性腹瀉患兒中CDAD所占比例。

1.2.3同源性分析對(duì)糞便培養(yǎng)出的艱難梭菌，用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)技術(shù)進(jìn)行同源性分析。該法為用7對(duì)引物分別對(duì)7個(gè)重復(fù)片段區(qū)域(表2)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min； 然后95 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min[10]。PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行重復(fù)片段計(jì)數(shù)。并用SPSS15.0軟件中hierarchical cluster法對(duì)結(jié)果分析，與參考文獻(xiàn)[10]中的菌株共同做成樹(shù)狀圖，顯示同源性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 糞便艱難梭菌毒素A檢測(cè)及培養(yǎng)結(jié)果

111名病例中未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌毒素A檢測(cè)及艱難梭菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性者，艱難梭菌毒素A檢測(cè)陽(yáng)性而艱難梭菌培養(yǎng)陰性者16例(即CDAD 16例)，艱難梭菌毒素A檢測(cè)陰性而艱難梭菌培養(yǎng)陽(yáng)性者4例，艱難梭菌毒素A檢測(cè)和艱難梭菌培養(yǎng)均為陰性者91例(表3)。

2.2 病例臨床分析

16例CDAD患者(CDAD組)腹瀉病程中位數(shù)為6.5 d，最短1 d，最長(zhǎng)3個(gè)月；糞常規(guī)檢查中，白細(xì)胞數(shù)超過(guò)5個(gè)/高倍鏡視野者3例；糞便主要以黃稀便為主，另有1例為黏液膿血便，1例為柏油樣黑便及黃稀便，1例為綠色稀便伴黏液膿血。在這些患者中，低出生體重早產(chǎn)兒3例，伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染者5例，伴呼吸系統(tǒng)感染者3例，伴尿路感染者2例，伴皮膚感染者2例，單純以腹瀉入院最終診斷為假膜性腸炎者1例。

表2MLVA目的VNTR片段及引物[10]

Tab.2ThetargetVNTRsequenceandprimersusedforPCR

VNTR nameRepeated motifPrimers used for PCRCD4TTGCTCCDR4F (5′-ATTAATCATATCCTACAGAACACGA-3′)CDR4R (5′-TAAAACAAATGATATAAACTGAAAAG-3′)CD5TATATTG/AGCDR5F (5′-AATTTTAAGTTAACGTTTTTCTACAT-3′)CDR5R (5′-AGCCATTTTTATCAATCCTTTCTAT-3′)CD9TAAAAGAGCDR9F (5′-TCTGGGATGTAACTAGCGACTTGT-3′)CDR9R (5′-TCTTAGGGAATTTATTGGAGGAA-3′)CD48ATAGATTCDR48F (5′-AGGAGCTTTATATGGACATTCAGGTAG-3′)CDR48R (5′-AATCTCTTTCAAACTCTTCAATCTCAAT-3′)CD49AT/AC/TTTCTCDR49F (5′-AACATATTTAGGCATTTTAGTC-3′)CDR49R (5′-GAGTATTATTTATCATTTGTGGGTATTA-3′)CD59TAAG/ATATA/GGAT/CCDR59F (5′-GTAGAAGGGGCAAATAATGAG-3′)CDR59R (5′-CCTTCTGGCTTCCTTGTAATA-3′)CD60G/ATAAA/GTAGGATG/ATAAAACDR60F (5′-GGTGCACATGCTGGTCCTG-3′)CDR60R (5′-AACGCATTAAATTTCAC-TCCTCATAC-3′)

表4院內(nèi)、外CDAD發(fā)生率的比較

Tab.4ComparisonofincidenceofCDADinchildrenwithhospital-acquiredandcommunity-acquireddiarrhea

TotalHospital-acquired diarrheaCommunity-acquired diarrheaAcute diarrhea13.58%(11/81)23.08%(6/26)9.09%(5/55)Persistent diarrhea18.18%(4/22)20.00%(1/5)17.65%(3/17)Chronic diarrhea12.50%(1/8)0.00%(0/0)12.50%(1/8)Total14.41%(16/111)22.58%(7/31)11.25%(9/80)

表3糞便艱難梭菌毒素A檢測(cè)及艱難梭菌培養(yǎng)結(jié)果

Tab.3DetectionofClostridiumdifficiletoxinAandcultureofClostridiumdifficile

Number of casesC. difficile culture (+)C. difficileculture (-)C. difficile toxin A (+)016C. difficile toxin A (-)491

The cut-off value forC.difficiletoxin A is 0.40.

比較院內(nèi)、外組3種不同病程腹瀉患兒中CDAD的發(fā)生率，均無(wú)顯著差異(表4)。

4例糞便艱難梭菌培養(yǎng)陽(yáng)性而艱難梭菌毒素A檢測(cè)陰性的患者(非CDAD組)均為院外出現(xiàn)腹瀉，其中3例為黃稀便，1例為黃稀便帶黏液血絲。腹瀉病程1～8 d。2例糞便白細(xì)胞數(shù)超過(guò)10個(gè)/高倍鏡視野，另2例糞便未發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞，但伴有呼吸系統(tǒng)感染。

91例艱難梭菌培養(yǎng)和艱難梭菌毒素A檢測(cè)均陰性的病例無(wú)艱難梭菌感染相關(guān)證據(jù)，糞便主要以黃稀便為主，腹瀉病程1 d～2年；糞常規(guī)檢查中白細(xì)胞數(shù)超過(guò)5個(gè)/高倍鏡視野者25例，伴其他部位感染者35例，新生兒5例(其中低出生體重早產(chǎn)兒2例)。

比較CDAD組與非CDAD組患兒腹瀉病程、糞便白細(xì)胞計(jì)數(shù)，均無(wú)顯著差異(結(jié)果未列出)。

2.3 臨床治療

16例CDAD患者中，2例加用甲硝唑治療后腹瀉好轉(zhuǎn)，2例加用去甲萬(wàn)古霉素治療后腹瀉好轉(zhuǎn)，1例低出生體重早產(chǎn)兒因合并新生兒壞死性腸炎而行造瘺手術(shù)治療。其他所有患者，均用第3代頭孢菌素抗感染和(或)十六角蒙脫石(思密達(dá))、培菲康對(duì)癥治療后腹瀉好轉(zhuǎn)。

2.4 同源性分析

從入選患者的糞便標(biāo)本中培養(yǎng)出4株艱難梭菌，分別為EK17、EK18、EK23和EK35，用MLVA對(duì)其同源性進(jìn)行分析 (圖1，圖中其他菌株來(lái)自參考文獻(xiàn)[4]中的數(shù)據(jù))，發(fā)現(xiàn)EK17與EK23的親緣關(guān)系較近，與EK35略遠(yuǎn)，EK18與其余菌株的同源性最遠(yuǎn)。

圖14株培養(yǎng)陽(yáng)性艱難梭菌同源性關(guān)系樹(shù)狀圖

Fig.1Dendrogramforthe4isolatedC.difficilestrains

3 討論

本研究從糞便培養(yǎng)出4株艱難梭菌，艱難梭菌毒素A檢測(cè)均為陰性。但是由于有少量毒素A陰性而毒素B陽(yáng)性的艱難梭菌毒株存在，故對(duì)僅有毒素A檢測(cè)陰性者雖考慮CDAD的可能性較低但尚不能完全排除。該4例培養(yǎng)陽(yáng)性病例均為社區(qū)散發(fā)病例，急性起病，入院前2周內(nèi)無(wú)住院史。腹瀉治療用藥均為普通抗生素，如第3代頭孢類(lèi)抗生素，或用十六角蒙脫石等對(duì)癥治療，平均腹瀉病程3.25 d。故結(jié)合臨床，考慮該4例患兒均為不產(chǎn)毒艱難梭菌感染的可能性較大。對(duì)該4株艱難梭菌進(jìn)行MLVA鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EK17、EK23、EK35間存在一定同源性，而EK18與前3者相差甚遠(yuǎn)。目前鑒定艱難梭菌同源性的方法有很多，包括MLVA、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多樣性分析(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、表面蛋白A基因序列分型(surface layer protein A gene sequence typing，slpAST)、核糖分型(PCR-ribotyping)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分型、限制性?xún)?nèi)切酶分析(restriction endonuclease analysis，REA)等。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，這些方法均能檢測(cè)出CDAD暴發(fā)菌株，但只有MLVA和REA能區(qū)別不同的CDAD暴發(fā)菌株。根據(jù)對(duì)各方法鑒定效果的評(píng)分結(jié)果，MLVA得分最高[11]，其結(jié)果比較可信。根據(jù)病史及鑒定結(jié)果，可推測(cè)上海部分地區(qū)腹瀉患兒發(fā)生的艱難梭菌感染是散發(fā)的，但彼此之間存在一定同源性。

在111名腹瀉患兒中，14.41%(16/111)為CDAD。國(guó)外報(bào)道，用組織培養(yǎng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)糞便艱難梭菌毒素，在有抗生素使用史的患者中，陽(yáng)性率為9%～23%[12]。雖然兩者檢測(cè)手段不同，但陽(yáng)性率并沒(méi)有很大差異，而本研究檢測(cè)艱難梭菌毒素A所用的ELISA比組織培養(yǎng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)更簡(jiǎn)便。以前國(guó)外研究認(rèn)為，CDAD主要散發(fā)或者暴發(fā)于醫(yī)院、護(hù)理院和慢性病診療中心，而社區(qū)發(fā)生率要低很多。在醫(yī)院或護(hù)理院等地，艱難梭菌的傳播主要是糞-口途徑，通過(guò)醫(yī)療相關(guān)工作者的接觸而進(jìn)行傳播?；颊咴诖罅渴褂脧V譜抗生素后對(duì)CDAD易感，CDAD發(fā)生率較高[5,13]。但近年來(lái)，該認(rèn)識(shí)與許多社區(qū)獲得性CDAD病例的發(fā)生明顯不符，且在社區(qū)進(jìn)行抗生素治療的患者中CDAD發(fā)生率亦不低[14]。本研究比較院內(nèi)、外CDAD的發(fā)生率，顯示急性、遷延性、慢性腹瀉之間無(wú)顯著差異；分別比較急性、遷延性、慢性腹瀉患者中院內(nèi)與院外CDAD發(fā)生率的高低，也未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明在本研究入組的患兒中，CDAD的發(fā)生與腹瀉病程、院內(nèi)或院外等因素?zé)o明顯相關(guān)性，與以往認(rèn)為CDAD病程長(zhǎng)、好發(fā)于院內(nèi)的觀點(diǎn)有所不同。這可能與本研究病例數(shù)不夠多有關(guān)，也可能與本研究病例主要為有抗生素應(yīng)用史患兒有關(guān)，還可能與我國(guó)的醫(yī)院管理模式不同于國(guó)外的護(hù)理院模式有關(guān)。國(guó)外研究認(rèn)為，嬰兒的腸道黏膜尚未成熟，艱難梭菌毒素難以與其結(jié)合，從而產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[5,15]。本研究中早產(chǎn)兒占CDAD病例總數(shù)的18.75%(3/16)，這可能也是CDAD病程沒(méi)有想象中長(zhǎng)的原因之一。

本文為回顧性研究，存在一定的局限性，包括未對(duì)糞便進(jìn)行艱難梭菌毒素B檢測(cè)，病史收集可能存在一定偏差，但結(jié)果可為進(jìn)一步深入前瞻性研究提供一些依據(jù)。另外，本研究對(duì)培養(yǎng)出的艱難梭菌進(jìn)行MLVA可成為今后鑒定CDAD暴發(fā)的較好手段。糞便艱難梭菌毒素A檢測(cè)目前在臨床應(yīng)用尚不普遍，本研究中檢出的陽(yáng)性率較高(16/111)，是診斷CDAD的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，但未觀察到該毒素的陽(yáng)性結(jié)果與臨床嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

[1] McDonald LC, Killgore GE, Thompson A, Owen RC, Kazakova SV, Sambol SP, Johnson S, Gerding DN. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile [J]. N Engl J Med, 2005, 353(23): 2433-2441.

[2] Kelly CP, LaMont JT. Clostridium difficile—More difficult than ever [J]. N Engl J Med, 2008, 359(18): 1932-1940.

[3] Salazar M, Baskin L, Garey KW, DuPont HL. Clostridium difficile-related death rates in Taxas 1999-2005 [J]. J Infect, 2009, 59(5): 303-307.

[4] Kim J, Smathers SA, Prasad P, Leckerman KH, Coffin S, Zaoutis T. Epidemiological features of Clostridium difficile-associated disease among inpatients at children’s hospital in the United States, 2001-2006 [J]. Pediatrics, 2008, 122(6): 1266-1270.

[5] Fekety R. Guidelines for the diagnosis and management of Clostridium difficile-associated diarrhea and colitis [J]. Am J Gastroenterol, 1997, 92(5): 739-750.

[6] Pokorn M, Radsel A, Cizman M, Jereb M, Karner P, Kalan G, Grosek S, Andlovic A, Rupnik M. Severe Clostridium difficile-associated disease in children [J]. Pediatric Infect Dis J, 2008, 27(10): 944-946.

[7] Huang H, Wu S, Wang M, Zhang Y, Fang H, Palmgren AC, Weintraub A, Nord CE. Clostridium difficile infections in a Shanghai hospital: antimicrobial resistance, toxin profiles and ribotypes [J]. Int J Antimicrob Agents, 2009, 33(4): 339-342.

[8] Benson L, Song X, Campos J, Singh N. Changing epidemiology of Clostridium difficile-associated disease in children [J]. Infect Control Hosp Epidemiol， 2007, 28(11): 1233-1235.

[9] Rexach CE, Tang-Feldman YJ, Cantrell MC, Cohen SH. Epidemiologic surveillance of Clostridium difficile diarrhea in a freestanding pediatric hospital and a pediatric hospital at a university medical center [J]. Diag Microbiol Infect Dis, 2006, 56(2): 109-114.

[10] Marsh JW, O’Leary MM, Shutt KA, Pasculle AW, Johnson S, Gerding DN, Muto CA, Harrison LH. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis for investigation of Clostridium difficile transmission in hospitals [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(7): 2558-2566.

[11] Killgore G, Thompson A, Johnson S, Brazier J, Kuijper Ed, Pepin J, Frost EH, Savelkoul P, Nicholson Brad, Berg RJ, Kato H, Sambol SP, Zukowski W, Woods C, Limbago B, Gerding DN, McDonald LC. Comparison of seven techniques for typing international epidemic strains of Clostridium difficile: restriction endonuclease analysis, pulsed-field gel electrophoresis, PCR-ribotyping, multilocus sequence typing, multilocus variable-number tandem-repeat analysis, amplified fragment length polymorphism, and surface layer protein A gene sequence typing [J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(2): 431-437.

[12] Klein EJ, Boster DR, Stapp JR, Wells JG, Qin X, Clause CR, Swerdlow DL, Braden CR, Tarr PI. Diarrhea etiology in a children’s hospital emergency department: a prospective cohort study [J]. Clin Infect Dis, 2006, 43(7): 807-813.

[13] 胡云建. 院內(nèi)感染艱難梭菌相關(guān)性腹瀉. 中國(guó)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 30(5): 618-621.

[14] Pituch H. Clostridium difficile is no longer just a nosocomial infection or an infection of adults [J]. Int J Antimicrob Agents, 2009, 33(Suppl 1): S42-S45.

[15] Deneve C, Janoir C, Poilane I, Fantinato C, Collignon A. New trends in Clostridium difficile virulence and pathogenesis [J]. Int J Antimicrobial Agents, 2009, 33(Suppl 1): S24-S28.