丙型肝炎病毒核心基因置換對病毒復(fù)制和感染影響的初步研究

黎剛，曹明媚，王文博，任浩，戚中田

第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護重點實驗室，上海200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是導(dǎo)致輸血后肝炎的主要病原體之一，與肝硬化和肝細(xì)胞癌高度相關(guān)[1]。HCV核心(core)蛋白是HCV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是一個具有膜蛋白特征的二聚化α螺旋蛋白[2]，由191個氨基酸組成，序列十分保守，各分離株的同源性超過95%。核心蛋白是從基因水平治療HCV感染和進行疫苗研究的重要區(qū)域，它在病毒增殖、慢性致病、肝細(xì)胞癌變、免疫功能障礙中起重要作用[3]，也是病毒衣殼包裝和產(chǎn)生感染性病毒顆粒的必要因素之一[4,5]。

核心蛋白在體外可非特異性結(jié)合核酸[6,7]。Duvignaud等[8]認(rèn)為，核心蛋白可能通過N端區(qū)域包裝基因組RNA。N端82個氨基酸缺乏二級結(jié)構(gòu)，在體外和酵母中能有效誘導(dǎo)并形成核衣殼樣顆粒(nucleocapsid-like particle，NLP)，而Majeau等[9]發(fā)現(xiàn)，僅需N端79個氨基酸就足夠在體外形成核衣殼蛋白。核心蛋白能與包膜糖蛋白E1和E2作用，與包膜區(qū)蛋白共同形成HCV的核衣殼[10,11]。

目前，核心蛋白在HCV復(fù)制中的作用還不明確。Goh等[12]用酵母雙雜交系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，核心蛋白能與NS5A的N端部分共沉淀，兩者相互作用所需的NS5A最小序列包括干擾素敏感決定區(qū)(interferon sensitivity-determining region，ISDR)、蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)結(jié)合區(qū)和富含Pro的區(qū)域。核心蛋白和NS5A通過與其他蛋白共同作用形成一個復(fù)合體結(jié)構(gòu)，但對病毒復(fù)制和感染性病毒顆粒組裝的具體作用還不清楚。Fan等[13]發(fā)現(xiàn)，核心蛋白可特異性結(jié)合HCV基因組的5′非編碼區(qū)，抑制病毒的翻譯過程。核心蛋白是與病毒RNA結(jié)合的核衣殼蛋白，而NS5A在HCV的復(fù)制中起重要作用，可以推測核心蛋白通過與其他蛋白直接或間接作用參與病毒的復(fù)制和組裝。

為探討HCV型間差異對病毒復(fù)制和感染的影響，本研究采用我國高流行性的HCV1b型HC-J4的核心區(qū)平行置換2a型FL-J6JFH1的相應(yīng)基因，構(gòu)建FL-J6JFH/J4 core復(fù)制子，轉(zhuǎn)染Huh7.5.1，分析核心基因置換后在病毒復(fù)制、蛋白翻譯和感染性病毒顆粒產(chǎn)生能力方面的變化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株和培養(yǎng)基含有HCV2a J6JFH1株全長基因組的質(zhì)粒pFL-J6JFH1由美國洛克菲勒大學(xué)HCV研究中心Charles M. Rice教授惠贈。含有HCV1b型J4全長cDNA的質(zhì)粒pGEM-J4和大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α由本實驗室保存。Huh7.5.1細(xì)胞由中國科學(xué)研究院巴斯德研究所鐘勁研究員提供。

1.1.2試劑QuikChange?LightningSite-Directed Mutagenesis Kit為Stratagene公司(美國)產(chǎn)品。異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal)、NZ胺(酪蛋白的酶促水解物)、酵母提取物等購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。14 ml BD Falcon聚丙烯管購自上海雅怡科學(xué)實驗設(shè)備有限公司。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗人IgG購自Jackson免疫研究所(美國)。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7)購自Promega公司(美國)。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司(美國)。RNA抽提試劑購自上海華舜生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1HCVJ4核心區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)采用重 疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法，以pGEM-J4為模板，擴增出J4 核心基因片段(該片段兩端含有J6核心基因兩端配對序列)，所用上游引物為J4-C-F： 5′-AAGCTTATGCATCACCATCACCATCACAGC-ACGAATCCTAAACC -3′，下游引物為J4-C-R：5′-GGATCCGAAGCGGAAGCTGGGATGGTC-3′(下劃線：引入的互補配對序列)。

1.2.2HCVJ4核心置換的pFL-J6JFH/J4core復(fù)制子的構(gòu)建回收J(rèn)4核心片段后作為大引物(megaprimer)，以pFL-J6JFH為模板進行熱循環(huán)反應(yīng)，擴增出pFL-J6JFH/J4 core質(zhì)粒，DpnⅠ消化原始的pFL-J6JFH模板后，轉(zhuǎn)化、鑒定，得到pFL-J6JFH/J4 core復(fù)制子，具體方法參照Stratagene公司的QuikChange?Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit操作說明。

1.2.3HCVRNA轉(zhuǎn)錄體的制備和Huh7.5.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染將FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4 core經(jīng)XbaⅠ線性化后，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備RNA體外轉(zhuǎn)錄體，RNase-free DNaseⅠ處理完全去除DNA模板后，用Tris飽和的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度。體外轉(zhuǎn)錄成RNA后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法和步驟參照Invitrogen公司的LipofectamineTM2000試劑盒要求。

1.2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCVRNA水平檢測設(shè)計HCV 5′非編碼區(qū)的特異性引物(上游引物為F-HCVN：5′-GCGTTAGTATGAGTGTCGTG-3′；下游引物為R-HCVN：5′-TCGCAAGCACCCTATCAG-3′)，預(yù)期產(chǎn)物213 bp。設(shè)計內(nèi)參照人GAPDH擴增引物(上游引物：5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′；下游引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′，預(yù)期產(chǎn)物100 bp)。

轉(zhuǎn)染后第5天，抽提轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA后以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[14]進行定量。HCV檢測的標(biāo)準(zhǔn)品是含有全長HCV cDNA的質(zhì)粒FL-J6JFH1 PCR后的純化產(chǎn)物(稀釋梯度為10-3～10-9)，GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)品是純化后的PCR產(chǎn)物(稀釋梯度為10-1～10-6)。將兩者梯度稀釋，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各實驗組樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算檢測樣品的濃度。經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH均一化后，即可算出轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA的水平。

1.2.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白表達細(xì)胞的檢測RNA轉(zhuǎn)染后第8天，以丙型肝炎患者血清(預(yù)實驗結(jié)果表明，以HCV單克隆抗體檢測的熒光結(jié)果弱于患者血清，故本文選取患者血清作為一抗進行免疫熒光檢測)為一抗，羊抗人-FITC為二抗，免疫熒光法(immunofluorescence assay, IFA)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV蛋白的表達。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照記錄。

1.2.6轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液HCV感染性檢測收集轉(zhuǎn)染后第8天的細(xì)胞上清液，1 467g離心10 min，去除可能存在的細(xì)胞碎片，分裝后保存在-80 ℃。na?ve Huh-7.5.1 按每孔3×104個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱孵育至40%～50%融合。加入收集的細(xì)胞上清液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。以丙型肝炎患者血清為一抗，IFA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV蛋白陽性細(xì)胞。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 HCV J4核心置換的pFL-J6JFH/J4 core復(fù)制子的構(gòu)建與體外轉(zhuǎn)錄

PCR擴增出HC-J4的核心基因片段(圖1)，克隆到pMD18-T載體上后進行測序驗證，用基因置換方法構(gòu)建了pFL-J6JFH/J4 core復(fù)制子，經(jīng)測序驗證，J6核心基因被J4核心基因成功置換。將FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core經(jīng)XbaⅠ線性化體外轉(zhuǎn)錄成RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，大小為6 000～10 000 bp(圖2)。

M, DNA marker 2000; 1, J4 core fragment.

圖1HCVJ4核心的PCR擴增結(jié)果

Fig.1AmplificationofJ4corebyPCR

1, FL-J6JFH1; 2, FL-J6JFH/J4 core; M, RNA marker 10000.

圖2FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4core轉(zhuǎn)錄體電泳

Fig.2GelelectrophoresisofsyntheticRNAtranscriptsofFL-J6JFH1andFL-J6JFH/J4core

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平的變化

將FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)錄體用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)，第5天用熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescent quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平。FL-J6JFH/J4 core的RNA水平約為5.6×105GE/μg RNA，與野生型相當(dāng)，無顯著性差異(n=4，P>0.05)。結(jié)果如圖3所示。

mean±SD.n=4,P>0.05.

圖3轉(zhuǎn)染第5天細(xì)胞內(nèi)HCVRNA水平

Fig.3IntracellularHCVRNAlevelsatday5post-transfection

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白陽性表達細(xì)胞的檢測

FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第8天，以丙型肝炎患者血清為一抗，羊抗人-FITC為二抗，IFA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV蛋白陽性細(xì)胞。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照。為更直觀比較陽性細(xì)胞數(shù)目的差異，選擇放大倍數(shù)為×100。結(jié)果表明，野生型FL-J6JFH1的陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的50%，而FL-J6JFH/J4 core陽性細(xì)胞約占30%，低于核心置換前的野生型FL-J6JFH1株的水平(圖4A)。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液HCV感染性檢測

FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第8天，收集細(xì)胞上清液，孵育 na?ve Huh-7.5.1細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后用IFA檢測HCV的表達。觀察同上。與對照FL-J6JFH1相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4 core的陽性細(xì)胞數(shù)減少(圖4B)。

圖4轉(zhuǎn)染第8天和用收集的第8天上清液孵育na?veHuh7.5.1細(xì)胞后的HCV陽性細(xì)胞的免疫熒光檢測

Fig.4ImmunofluorescenceassayofHCVproteinsinHuh7.5.1cellstransfectedwithRNA(A)orinfectedwithsupernatantsfromtransfectedcells(B)atday8

3 討論

本研究用基因置換法構(gòu)建了HCV FL-J6JFH/J4 core嵌合復(fù)制子，體外轉(zhuǎn)錄成RNA后轉(zhuǎn)染Huh7.5.1肝癌細(xì)胞。Wakita等曾做過RNA 印跡(Northern blot)實驗，結(jié)果在轉(zhuǎn)染后12 h檢測到降解的RNA轉(zhuǎn)錄體，24 h即可檢測到新產(chǎn)生的HCV RNA[15]。本研究檢測到轉(zhuǎn)染后第5天FL-J6JFH/J4 core細(xì)胞內(nèi)RNA水平與野生型FL-J6JFH1相當(dāng)，這意味著在復(fù)制起始或延伸過程中，HCV J6核心和J4核心與其他復(fù)制相關(guān)蛋白結(jié)合的活力可能相當(dāng)，高度保守的核心區(qū)在HCV各株間自由置換對HCV的復(fù)制能力不起或起較小作用。

HCV FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第8天，IFA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV的表達。結(jié)果顯示，F(xiàn)L-J6JFH/J4 core陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例與野生型相比明顯下降，提示J4核心基因替換后引起HCV蛋白翻譯能力減弱，原因可能是在HCV結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白翻譯過程中，J4核心蛋白與翻譯相關(guān)蛋白作用的活性弱于J6核心蛋白。說明核心蛋白可能對HCV蛋白的翻譯有較大作用，各株之間相互置換，雖然氨基酸序列變化不大，但在一定程度上改變了HCV的蛋白翻譯能力。

收集HCV FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第8天的細(xì)胞上清液，孵育na?ve Huh7.5.1細(xì)胞。IFA檢測發(fā)現(xiàn)，與對照FL-J6JFH1相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4 core的陽性細(xì)胞數(shù)大幅減少。表明在HCV感染性病毒顆粒的包裝或釋放過程中，J4核心基因置換后會降低與其他相關(guān)蛋白的作用，使整體感染力降低。在IFA檢測實驗中，我們嘗試使用NS3或NS5A的單克隆抗體，但效果不如用丙型肝炎患者血清敏感。Kato等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HCV的開放閱讀框架(open reading frame，ORF)編碼的多聚蛋白前體，在宿主細(xì)胞信號肽酶和病毒蛋白酶作用下，裂解產(chǎn)生核心蛋白前體(p23)，再經(jīng)膜內(nèi)蛋白酶SPP(信號肽酶)作用，形成成熟的p21[17,18]。成熟的p21有明顯的二級結(jié)構(gòu)，并能自折疊形成大至24個單體的多聚體，其中C端的125～179位氨基酸起重要作用。核心蛋白多聚體的具體功能還不清楚。Kunkel等[6]認(rèn)為，核心蛋白11S可能是HCV病毒顆粒組裝的中間體形式，組裝時核心蛋白積聚，可加速病毒核衣殼的形成，降低形成感染性病毒顆粒所必需的核心蛋白與其他蛋白的相互作用。用J4核心區(qū)平行置換野生型FL-J6JFH的核心區(qū)后，有可能影響核心蛋白的加工、成熟、自組裝和功能性11S蛋白作用的發(fā)揮。

上述初步研究表明，HCV 核心蛋白很可能在HCV感染性病毒顆粒的釋放中起重要作用。目前，我們正在長時間觀察FL-J6JFH/J4 core RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RNA的消長，以及核心基因置換后對感染性病毒顆粒的影響，以進一步明確核心蛋白在HCV復(fù)制和感染性顆粒產(chǎn)生中的作用。

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