環(huán)孢素A對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及iNOS表達(dá)的影響

杜家琇 婁季宇 白宏英 曾志磊 楊霄鵬 王金蘭

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

研究證實(shí)，免疫炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用［1］，小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）是神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌系統(tǒng)的核心細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程有關(guān)［2］，腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)、釋放和（或）分泌多種神經(jīng)毒性物質(zhì)、炎性因子和酶導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害，其中iNOS是小膠質(zhì)細(xì)胞影響腦缺血損傷進(jìn)展的關(guān)鍵因素，其細(xì)胞定位以小膠質(zhì)細(xì)胞為主［3］，由iNOS造成NO的過(guò)度釋放，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。因此，減少腦缺血再灌注MG的激活，可以起到神經(jīng)保護(hù)作用［4］。抑制MG活化或減少其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性物質(zhì)將是治療腦缺血的新思路。環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）是一種抗器官移植排斥反應(yīng)的特效藥物，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CsA可以降低小膠質(zhì)細(xì)胞活性，有神經(jīng)保護(hù)作用［5］，但在大鼠腦缺血－再灌注損傷方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)環(huán)孢素A干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及免疫炎性反應(yīng)以減少病理?yè)p害，為臨床治療腦缺血性疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇 健康SD大鼠72只，清潔級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量（240±30）g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 分組、給藥方法 隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、環(huán)孢素A組，每組24只，各亞組均為6只，干預(yù)組從手術(shù)后2h到手術(shù)后2周，每天腹腔注射環(huán)孢素A（20mg／kg），模型組和假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水。

1.3 腦缺血－再灌注模型的制備 參照Longa等報(bào)道的線栓法［6］并加以改進(jìn)，制備局灶性腦缺血－再灌注模型（MCAO），栓線長(zhǎng)45mm，線身直徑0.26mm，線頭直徑0.34mm，距頭端20mm做標(biāo)記，術(shù)前12h大鼠禁食不禁水，模型組及環(huán)孢素A組均進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞。栓線插入深度18～22mm，缺血120min時(shí)，拔出栓線約10mm，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈。

1.4 模型動(dòng)物神經(jīng)功能缺陷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及選擇 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分按照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］，0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（爬行時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（行走時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒）；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)障礙。1～3分的動(dòng)物模型為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 OX－42、iNOS免疫組織化學(xué)染色 各相關(guān)時(shí)間點(diǎn)大鼠在麻醉后經(jīng)左心室灌注，即切開胸骨，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，繼用4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，浸入固定液中過(guò)夜，脫水、透明、浸蠟，冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚為4μm。免疫組織化學(xué)染色（SP），顯微鏡下觀察OX－42、iNOS表達(dá)情況。

1.6 圖像采集分析 采用德國(guó)Lecia顯微照相系統(tǒng)采集圖片，Biosens Digital Imaging System v1.6分析系統(tǒng)對(duì) OX－42及iNOS的表達(dá)進(jìn)行定量分析。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下的陽(yáng)性區(qū)平均灰度值，以5個(gè)視野的平均灰度值的平均值作為該例的測(cè)量值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，α＝0.05為顯著性檢驗(yàn)性水準(zhǔn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 大鼠局灶腦缺血／再灌注后各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 （）

表1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 （）

注：與模型組比較，★P＜0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術(shù)組 24 0 0 0 0模型組 24 2.39±0.56 2.25±0.25 2.05±0.45 2.12±0.49環(huán)孢素 A組 24 2.20±0.35★ 1.93±0.72★ 1.82±0.13★ 1.88±0.13★

2.2 海馬一區(qū)OX－42免疫組化檢測(cè)分析 見(jiàn)表2。假手術(shù)組可見(jiàn)少許OX－42陽(yáng)性表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞，模型組1d即有OX－42的大量表達(dá)，3d時(shí)達(dá)峰，7d下降但仍高于正常，14d時(shí)接近正常，環(huán)孢素組較模型組表達(dá)減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異。

表2 3組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX－42陽(yáng)性區(qū)平均灰度值 （）

表2 3組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX－42陽(yáng)性區(qū)平均灰度值 （）

注：與假手術(shù)組比較，★P＜0.05，●P＞0.05；與模型組比較，△P＜0.05，□P＞0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術(shù)組 24 105.03±5.37 108.42±8.96 103.17±7.73 106.54±9.27模型組 24 135.60±5.11★ 154.97±4.62★ 125.31±4.32★ 105.31±3.15●環(huán)孢素 A組 24 122.92±3.46★△ 134.49±4.45★△ 113.82±5.80★△ 106.14±3.90●□

2.3 海馬一區(qū)iNOS免疫組化檢測(cè)分析 見(jiàn)表3。假手術(shù)組海馬一區(qū)未見(jiàn)iNOS陽(yáng)性表達(dá)，模型組1d時(shí)iNOS表達(dá)最高，3d時(shí)下降但仍高于正常，7d時(shí)接近正常，環(huán)孢素組較模型組表達(dá)減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異。

表3 3組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS陽(yáng)性區(qū)平均灰度值 （）

表3 3組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS陽(yáng)性區(qū)平均灰度值 （）

注：與假手術(shù)組比較，★P＜0.05，●P＞0.05；與模型組比較，△P＜0.05，□P＞0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d假手術(shù)組 24 101.11±4.69 100.16±5.36 102.54±6.39 106.84±3.02模型組 24 148.69±5.09★ 126.32±6.65★ 105.37±4.12● 106.49±5.08●環(huán)孢素 A組 24 131.94±4.05★△ 115.19±5.75★△ 106.17±4.06●□ 103.94±3.44●□

3 討論

缺血性腦血管病在腦卒中的發(fā)生率高達(dá)80%，無(wú)特效治療方法。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)以及神經(jīng)影像學(xué)等基礎(chǔ)研究技術(shù)的發(fā)展，對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。腦缺血再灌注損傷總是伴隨著免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，這個(gè)過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞起了關(guān)鍵作用，小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要、最活躍的免疫炎癥細(xì)胞，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是干預(yù)缺血性腦損傷的方法之一，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷中的重要性將會(huì)是以后研究的重點(diǎn)［7］。本實(shí)驗(yàn)顯示，急性腦缺血再灌注損傷后，大鼠海馬一區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，較對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），應(yīng)用環(huán)孢素A后，隨著OX－42的減少，其神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分優(yōu)于模型組，顯示了小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加與神經(jīng)元受損程度相一致，與再灌后腦損傷的程度可能成正相關(guān)。

激活后的MG一方面與神經(jīng)細(xì)胞直接接觸，發(fā)揮直接的毒性作用，另一方面產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)系十分密切，其中研究最多的是NOS，NOS分為神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）3種亞型，iNOS主要由 MG在一定的環(huán)境條件下產(chǎn)。Ladecola C等［8］研究發(fā)現(xiàn)iNOS利用精氨酸、氧氣和NADHP產(chǎn)生NO，是腦缺血再灌后損傷過(guò)程中的關(guān)鍵因素。我們?cè)囼?yàn)結(jié)果表明，iNOS在腦缺血再灌后損傷過(guò)程中大量表達(dá)，其表達(dá)的程度和神經(jīng)功能障礙的程度相一致。

環(huán)孢素A是一種特效的免疫抑制劑，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A對(duì)腦缺血－再灌注損傷具有腦保護(hù)作用。研究表明其腦保護(hù)作用機(jī)制主要有幾個(gè)方面：（1）抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）活性；（2）封閉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP），維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能；（3）降低小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)及活性。然而對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞方面研究很少，本實(shí)驗(yàn)主要從這方面入手，結(jié)果顯示環(huán)孢素A組大鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及iNOS的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分優(yōu)于模型組，顯示了環(huán)孢素A的神經(jīng)保護(hù)作用在于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和iNOS的活性。

資料表明，環(huán)孢素有諸多不良反應(yīng)。在我們實(shí)驗(yàn)中，由于應(yīng)用療程短，未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，其治療的安全性和有效性有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Wang Q，Tang XN，Yenar MA.The inflammatory response in stroke［J］.Journal of Neuroimmunology，2007，184（1／2）：53－68.

［2］Gehrman J，Matsumoto Y，Kreutzbery GW.Microglia：intrinsic immunoeffector cell of the brain［J］.Res Rev，1995，20（3）：269－287.

［3］王楓濤，范生堯 .局灶性腦缺血再灌注時(shí)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在大鼠腦組織的分布特點(diǎn)［J］.四川醫(yī)學(xué)雜志，2009，30（3）：306－308.

［4］Lao CJ，Lin JG，Kuo JS，et al.Microglia，apoptosis and interleukin－1βexpression in the effect of sophora japonical on cerebral infarct induced by ischemia－reperfusion in rats［J］.Am J Chin Med，2005，33：425－438.

［5］Yu Y，Chen XQ，Cui YY，et al.Electrophysiological actions of cyclosporine A and tacrolimus on rat hippocampal CA1pyramidal neurons［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（12）：1 891－1 897.

［6］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［7］Faraco G，F(xiàn)ossati S，Bianchi ME，et al.High mobility group box I protein is released by neural cells upon different stresses and worsens ischemic neurodegeneration in vitro and in vivo［J］.J Neurochem，2007，103：590－603.

［8］Iadecola C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury［J］.Trends Neurosci，1997，20：132－139.