牛膝多糖對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用*1

徐曉燕 張志港 辛?xí)悦?王 浩

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271016； 2. 泰山醫(yī)學(xué)院2004級藥學(xué)本科，山東 泰安 271016)

牛膝(AchyranthesbidentataBL)又名百倍，雞膠骨，為莧科多年生草本植物，根為藥用部分，是我國的一種傳統(tǒng)中藥。其味苦、酸，性平，入肝腎經(jīng)。中華人民共和國藥典(2005年版)上記載：牛膝有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效[1]。牛膝根含三萜皂甙、甾體類、糖類、氨基酸、生物堿類和香豆素類化合物等，其中多糖是其重要的活性成分之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗生物分子氧化等活性。本課題前期的研究表明，牛膝多糖對四氯化碳所致化學(xué)性肝損傷有一定保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了牛膝多糖對BCG(卡介苗)+LPS(脂多糖)聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫性肝損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

牛膝由泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院購進(jìn)，經(jīng)本院生藥學(xué)教研室鑒定為懷牛膝；聯(lián)苯雙酯滴丸，德州德藥制藥公司，批號061005 ；無水乙醇，分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，批號為080215；0.9%氯化鈉注射液(normal NS)，山東省泰安制藥廠，批號07033102；GPT、SOD、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；卡介苗，上海生物制品研究所；脂多糖，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

BT-815A自動(dòng)生化測試分析系統(tǒng)，上海三科儀器有限公司；電子分析天平AR2140，奧豪斯(上海)公司；LXJ-IIB型低速大容量離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，由泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 方法

1.4.1牛膝多糖的提取純化和含量測定[2]取粉碎至適當(dāng)顆粒的牛膝藥材40 g，置1000 ml容量瓶中加80%乙醇200 ml浸泡14 h，微沸回流脫脂2次，每次2 h。殘?jiān)鼮V干置1000 ml圓底燒瓶中按料液比1︰15加水600 ml，80℃，提取兩次，每次3 h。合并兩次提取的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至約100 ml。Savage試劑法脫蛋白，加入3倍的Savage試劑充分震蕩混勻，5000 r/min離心15 min，取上清液重復(fù)脫蛋白操作2次，至不再出現(xiàn)蛋白。將所得溶液按1︰5加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置一夜，5000 r/min離心15 min，所得粉末用CCl4洗滌2次，乙醚洗滌2次，每次洗滌后離心。干燥的白色粉末即為牛膝多糖，用苯酚—硫酸法測定所提取牛膝多糖含量為74.28%。

1.4.2動(dòng)物分組與給藥 取小鼠60只，雌雄各半，按性別和體重隨機(jī)分為5組。①生理鹽水對照組；②模型對照組；③聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1·d-1陽性對照組；④⑤分別為牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1實(shí)驗(yàn)組。③組灌胃聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1·d-1，④⑤組分別灌胃牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1，①②組分別灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)給藥10天。參照文獻(xiàn)[3]，制作小鼠免疫性肝損傷模型，即由尾靜脈注射0．2 ml內(nèi)含2.0 mg BCG的生理鹽水溶液，10 d后每鼠尾靜脈注射7.5 μg LPS。12 h后小鼠摘眼球取血，4000 r/min離心15 min分離血清，測定血清中ALT的含量。上述取血后處死小鼠剖取出肝臟、胸腺、脾臟。肝臟置生理鹽水中洗凈血液，拭干稱取0.5 g用冷生理鹽水制成10%肝勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清測定ALT、 MDA、SOD的含量。胸腺、脾臟稱其質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)=臟器重(mg)/體重(g)]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠血清和肝組織中ALT的影響

由表1可見，與正常對照組比較，模型組小鼠血清和肝組織ALT顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比，牛膝多糖低劑量組與聯(lián)苯雙酯組小鼠血清和肝組織ALT均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠血清和肝組織中ALT的影響

注：與NS對照組比較：#P<0.05；與模型對照組比較：*P<0.05。

2.2 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平明顯升高， SOD水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯能明顯降低肝勻漿MDA的含量，提高SOD的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響

注：與NS對照組比較：#P<0.05；與模型對照組比較：*P<0.05。

2.3 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

由表3可見，與正常對照組比較，模型組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，表明BCG+LPS損傷后導(dǎo)致脾臟、胸腺增大。與模型組相比，低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯能降低增大的脾臟、胸腺的質(zhì)量指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

注：與NS對照組比較：##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。

3 討 論

目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乙型肝炎病毒感染引起的肝損傷主要與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)[4-5]，采用BCG+LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷病理改變與肝細(xì)胞損傷機(jī)制均與乙型病毒性肝炎相類似。以BCG+LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠制造免疫性肝損傷小鼠模型，較以往用化學(xué)物質(zhì)造成的肝損傷模型在病理生理機(jī)制上更接近人體肝炎。給小鼠注射卡介苗可使巨噬細(xì)胞和中性多核粒細(xì)胞聚集于肝臟,使肝臟處于致敏狀態(tài)，繼而用低毒劑量的脂多糖攻擊,可激發(fā)這些細(xì)胞釋放TNFα等炎癥因子,造成肝臟炎癥、壞死[6]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠血清和肝組織ALT顯著升高，肝細(xì)胞受到明顯損傷，脾臟、胸腺質(zhì)量指數(shù)增大，說明模型建立成功。低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯均能降低肝損傷小鼠血清和肝勻漿中轉(zhuǎn)氨酶的水平，降低增大的脾臟、胸腺的質(zhì)量指數(shù)，提示牛膝多糖可明顯減輕肝細(xì)胞損傷。MDA和SOD是反映脂質(zhì)過氧化損傷的指標(biāo)，可間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖低劑量可降低肝勻漿MDA的含量，使降低的SOD活性升高，表明牛膝多糖有一定的肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定作用，這可能與其清除自由基等抗氧化作用密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖高劑量表現(xiàn)一定的保肝、抗氧化的趨勢，但多數(shù)缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

以上研究提示，牛膝多糖可保護(hù)BCG+LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的免疫性肝損傷，其抗氧化作用可能是其保肝降酶作用的重要機(jī)制之一。

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