缺血后處理對(duì)大鼠腸缺血再灌注致肺脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用*

姚樹(shù)桐，商戰(zhàn)平，桑 慧，方永奇，于鳳秀，王家富

(泰山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山東 泰安 271000)

腸缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、心肺功能不全等救治過(guò)程中共有的病理過(guò)程，不僅導(dǎo)致腸組織本身?yè)p傷，而且通過(guò)氧化應(yīng)激、炎癥細(xì)胞活化等機(jī)制對(duì)遠(yuǎn)隔器官尤其是肺的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生廣泛影響，甚至導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dyfunction syndrome，MODS)[1]，因此研究腸I/R損傷的發(fā)生與防治具有重要臨床意義。調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制是防治I/R損傷最有效的措施，缺血后處理(ischemic postconditioning, I-post C)，即在組織缺血后持續(xù)再灌注前多次短暫再灌注/缺血處理，是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，其保護(hù)作用已在多種屬動(dòng)物不同器官如心、肝、肺、小腸等I/R損傷模型上得到證實(shí)，且因其可在缺血后實(shí)施而具有良好的臨床應(yīng)用前景[2]。既往有關(guān)I-post C內(nèi)源性保護(hù)及其機(jī)制研究主要側(cè)重于其對(duì)I/R組織器官本身的保護(hù)，但是否可通過(guò)調(diào)動(dòng)全身性?xún)?nèi)源性保護(hù)機(jī)制對(duì)遠(yuǎn)隔器官發(fā)揮保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本工作在既往已證實(shí)腸I-post C可減輕大鼠小腸I/R損傷[3]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究腸缺血后處理(intestinal ischemic postconditioning，II-post C)和肢體缺血后處理(limb ischemic postconditioning，LI-post C)對(duì)小腸I/R大鼠肺組織損傷的影響，并初步探討其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年健康雄性Wistar大鼠32只，體重230～280 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(魯)2008-0019。

1.2主要試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3動(dòng)物模型制備

術(shù)前禁食12 h，自由飲水，以20%烏拉坦(1.6 g/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，右側(cè)腹股溝區(qū)分離股動(dòng)脈，并按照既往報(bào)道的方法[3]復(fù)制小腸I/R損傷模型，即取腹正中切口，鈍性游離腸系膜上動(dòng)脈(super mesenteric artery，SAM)，在其根部以無(wú)創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉阻斷血流45 min造成小腸缺血，然后打開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注120 min。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

32只大鼠隨機(jī)分為4組(n=8)，①假手術(shù)(Sham)組：僅游離右股動(dòng)脈和SAM，不做I/R處理；②缺血/再灌注(I/R)組：方法見(jiàn)模型制備；③腸缺血后處理(II-post C)組：夾閉SAM 45 min后即刻行3輪1 min灌注/1 min缺血，再灌注120 min結(jié)束實(shí)驗(yàn)；④肢體缺血后處理(LI-post C)組：夾閉SAM 39 min，然后用動(dòng)脈夾夾閉右股動(dòng)脈1 min，松開(kāi)1 min，反復(fù)3個(gè)循環(huán)，最后小腸再灌注120 min結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1肺功能測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈取血(與空氣隔離)，進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?丹麥雷度ABL-700血?dú)夥治鰞x)測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.5.2肺系數(shù)(lung index，LI)測(cè)定 迅速取出肺臟，于氣管分叉處上1 cm處剪斷，稱(chēng)重，計(jì)算肺系數(shù)(LI=肺濕重/體重×100)。

1.5.3肺病理學(xué)檢查 取右肺上葉相同部位約1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊，10%甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀(guān)察形態(tài)學(xué)改變。

1.5.4血漿MDA和SOD測(cè)定 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血約3 ml，肝素抗凝，2500 r/min 離心10 min，收集血漿，分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)檢測(cè)血漿MDA含量和SOD活性，具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5.5肺組織MDA和SOD測(cè)定 取右肺下葉相同部位肺組織約500 mg，冰浴條件下制備組織勻漿，3000 r/min離心10 min，收集上清，Bradford法蛋白定量，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定肺組織MDA含量和SOD活性。

2 結(jié) 果

2.1血?dú)庵笜?biāo)PaO2和PaCO2變化

與Sham組比較，I/R組PaO2顯著降低，PaCO2明顯升高，分別為Sham組的59.6%(P<0.01)和134.2%(P<0.01)；II-post C和LI-post C均明顯改善肺功能，其PaO2分別較I/R組升高33.8% (P<0.01)和22.3% (P<0.05)，PaCO2分別降低16.3% (P<0.05)和12.6% (P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2肺系數(shù)變化

I/R組肺系數(shù)明顯增高，為Sham組的1.5倍(P<0.01)；II-post C組和LI-post C組肺系數(shù)分別較I/R組減小20.7%(P<0.01)和16.1%(P<0.01)，但仍明顯高于Sham組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3肺組織病理學(xué)改變

Sham組肺泡大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，壁薄，未見(jiàn)出血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組可見(jiàn)肺泡大小不均，完整性破壞，肺泡腔有蛋白樣滲出物，肺泡壁增厚，間隔增寬，肺間質(zhì)和肺泡水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，充血、出血明顯。II-post C和LI-post C均減輕上述病理變化，肺泡腔內(nèi)蛋白滲出減少，肺泡壁增厚、炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見(jiàn)圖1。

表1 血?dú)庵笜?biāo)和肺系數(shù)變化

注：與sham組比較，△P<0.05,△△P<0.01；與I/R組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖1 肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

2.4肺組織和血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量變化

I/R組大鼠肺組織和血漿SOD活性明顯降低，而MDA含量增加，與Sham組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與I/R組比較，II-post C組和LI-post C組肺組織和血漿SOD活性升高，而MDA含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 肺組織和血漿SOD、MDA變化

注：與sham組比較，△P<0.05,△△P<0.01；與I/R組比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

腸是體內(nèi)代謝活躍、具有獨(dú)特免疫功能的器官，是體內(nèi)最大的致病菌庫(kù)，被認(rèn)為是MODS 的“啟動(dòng)器官”，而腸I/R損傷是其主要原因之一[1]。腸I/R后不僅導(dǎo)致腸組織本身?yè)p害，而且對(duì)遠(yuǎn)隔器官結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生廣泛影響，其中最常見(jiàn)的是肺損傷，且往往出現(xiàn)較早[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸缺血45 min再灌注2 h后，肺組織明顯水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺系數(shù)增大，且肺功能受損，表明腸I/R可導(dǎo)致嚴(yán)重肺損傷，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致。

I-post C作為一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，具有重要的理論與臨床實(shí)用價(jià)值。既往大量研究證實(shí)I-post C對(duì)心[5]、腦[6]、小腸[3]等I/R器官尤其是I/R器官本身具有保護(hù)作用，但是其對(duì)于I/R所致遠(yuǎn)隔器官損傷是否仍具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本工作在大鼠小腸I/R損傷模型上證實(shí)，無(wú)論是腸I-post C還是腸外器官(肢體)I-post C均顯著改善腸I/R所致肺功能障礙，減輕肺組織病理學(xué)改變和肺水腫程度，表明I-post C不僅可減輕I/R組織本身?yè)p傷，而且通過(guò)調(diào)動(dòng)全身性?xún)?nèi)源性保護(hù)機(jī)制對(duì)遠(yuǎn)隔器官也具有保護(hù)作用。

氧自由基在再灌注損傷中起重要作用，介導(dǎo)整個(gè)損傷過(guò)程，其對(duì)組織細(xì)胞的主要損害是造成脂質(zhì)過(guò)氧化。MDA 和SOD 是反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度的一對(duì)指標(biāo)。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化所形成的，其含量變化可反映組織氧化損傷的程度；而SOD 是超氧陰離子清除劑，其活力高低可反映機(jī)體清除自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠腸I/R后，血漿和肺組織MDA含量較假手術(shù)組明顯升高，而SOD活性顯著降低，表明脂質(zhì)過(guò)氧化是導(dǎo)致腸I/R大鼠肺損傷的基本機(jī)制；于缺血后再灌注前實(shí)施的腸I-post C和肢體I-post C均顯著上調(diào)血漿和肺組織SOD活性、減少M(fèi)DA生成，提示I-post C可調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制減輕脂質(zhì)過(guò)氧化所介導(dǎo)的腸I/R大鼠肺損傷，其細(xì)胞分子機(jī)制正在研究中。

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