風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法及參考標準的建立

趙立紅

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院檢驗科，山東 泰安 271000 )

風疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎癥。風疹病毒感染最嚴重的問題是孕婦感染可導致對嬰兒的先天性損害，尤其前3個月感染風疹病毒，可通過胎盤感染胎兒，導致孕婦流產(chǎn)、死胎，或新生兒一系列的器官畸形等先天性風疹綜合癥(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。為了盡早檢測臨床標本中風疹病毒，避免出生缺陷，本研究建立了風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法，并構建了RV實時熒光定量RT-PCR參考標準，為臨床應用中風疹診斷提供簡便、快捷、準確、定量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1病毒株、質(zhì)粒、試劑與儀器 風疹病毒疫苗RA27/3株購自泰安市疾控中心。質(zhì)粒pET30a(+)由山東大學醫(yī)學院病原生物學研究所趙蔚明教授惠贈。Taq DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT購自Takara公司。UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒、SK1191 UNIQ-10柱離心式質(zhì)粒DNA小抽試劑盒均購自上海生物工程有限公司。E.Z.N.A. DNA凝膠回收試劑盒購自美國Omega公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。T-1型熱循環(huán)儀為德國Biometra公司產(chǎn)品。尤尼柯紫外可見分光光度計為上海尤尼柯儀器有限公司。PE7300實時熒光定量PCR擴增分析儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2定量標準品的制備

1.2.1風疹病毒疫苗RA27/3株RNA的制備及cDNA合成 UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒提取風疹病毒疫苗RA27/3株中RV RNA，嚴格按試劑盒說明書操作。0.5 ml反應管中逆轉(zhuǎn)錄反應體系總體積為20 μl，包含 4.0 μl RT buffer (5×)，1.0 μl AMV RTase(5 U/μl)×L，4.0 μl dNTPs (2.5 mM)，0.5 μl RNase inhibitor (40 U/μl)，1.0 μl Random 9 Primer (50 pmol/μl)，5.0 μl RV RNA 模板，4.5 μl DEPC 雙蒸水。將混合物振蕩混勻，離心30 s，于PCR儀里按下列條件反應運行，30℃10 min，42℃60 min，99℃5 min，5℃ 5 min，合成RV cDNA。

1.2.2RV基因特異性PCR擴增子作為參考標準品 根據(jù)RV RA27/3基因序列(GeneBank no. X14871.1)，引物設計、反應體系及反應條件參照文獻[2]。上游引物：5′-ATGCGTCCGCTTTGAGTC -3′，下游引物：5′-TATGTCCGTGCGGCGTGTTAG-3′，引物序列由上海博亞有限公司合成；以合成的RV RA27/3 cDNA為模板按下列反應體系和條件擴增目的片斷；50 μl反應體系中：上下游引物各1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl， 10×LA PCR Buffer II (Mg2+Free) 5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl， 四種dNTP混合物8 μl(各2.5 mM)，pBluscriptII SK-E1 DNA模板10 μl，三蒸水19.5 μl；反應條件：93°C 4 min 預變性， 93°C 變性45 s，55°C退火1 min，72°C延伸3 min，共35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。然后,將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察，切取相應的條帶純化回收。

1.2.3RV基因特異性PCR擴增子標準品的定量及純度測定 取10 μl純化的PCR RV cDNA 樣品稀釋到500 μl，采用紫外分光光度計法測定OD260nm，換算成樣品的拷貝濃度，重復三次取平均值，以確定該標準品的濃度；測定OD260nm/OD280nm分析其純度。將確定濃度及純度的RV PCR擴增子標準品，進行一系列整倍數(shù)稀釋，-70℃保存，用作后繼研究中RV實時熒光定量RT-PCR定量標準品。

1.3RV 實時熒光定量RT-PCR 上、下游引物采用上述制備RV基因特異性PCR擴增子標準品的引物，TaqMan 探針設計，反應體系及反應條件參照文獻[2]，TaqMan 探針序列：5′-GATTGTGGACGGCGGCT-3′，由上海博亞有限公司合成。優(yōu)化的50μl PCR 反應體系中，包含10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)緩沖液5 μl，上下游引物各1.0 μl(25 μM)，TaqMan熒光探針1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq 聚合酶(5 U/μl ) 0.5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl，4 種dNTP 混合物8 μl(各2.5 mM)，樣本cDNA、107～102不同梯度稀釋的標準品cDNA模板、陰性對照(三蒸水)及陰性對照DNA(質(zhì)粒pET30a(+))各10 μl。優(yōu)化的反應條件：94℃預變性2 min，然后94℃變性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸30 s，先做10個循環(huán)，最后94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，做30個循環(huán)。于PE7300全自動PCR擴增分析儀上進行 PCR 擴增。

1.4統(tǒng)計學方法 直線回歸與相關應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1定量陽性標準品制備及定量 RV基因特異性PCR擴增子標準品為RVE1高度保守區(qū)一段503 bp的序列(圖1)。紫外分光光度計法定量該特異性PCR RV cDNA標準品，測OD260nm，OD值為0.014，然后算出該RV cDNA的質(zhì)量濃度為2.75×109拷貝/μl。OD260nm/OD280nm為1.95，示該定量標準品具有92%的純度。

圖1 RV基因特異性PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳M: Marker DL2000，1. 陰性對照，2. RV基因片斷PCR 結(jié)果(503 bp)

2.2定量陽性標準動力學曲線、標準回歸曲線的建立及回歸方程的設定 10倍系列稀釋的標準品cDNA(2.75×107～2.75×102拷貝/反應)在PE7300全自動實時熒光定量PCR儀上擴增后，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，自動生成標準動力學曲線。系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，通過baseline 的設定，自動生成標準回歸曲線。標準曲線是以循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)為縱坐標，以陽性標準模板基因拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標的一條嚴格的直線型曲線，由標準回歸曲線可以看出,該標準品不同稀釋度的各個有效反應點均落在標準曲線的相應位置上,線性相關系數(shù)r為-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，表明10倍系列稀釋的不同濃度的標準品cDNA的自然對數(shù)值與相應的Ct值具有良好的相關性，證實了本研究建立的風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法定量的準確性。系統(tǒng)運行Analysis 過程,生成回歸方程為:y =-3.15x +31.29。

3 討 論

風疹是由風疹病毒引起的一種全球性傳染病，人群對風疹病毒普遍易感，給人類健康帶來極大危害。育齡婦女特別是孕婦早期感染常常具有危及胎兒導致胎兒致畸或死胎以及引起自然流產(chǎn)的危險。為提高出生人口質(zhì)量，降低異常妊娠的發(fā)生率及自然流產(chǎn)次數(shù)，采用簡便、快速、準確、定量的實驗室診斷方法具有十分重要的意義。

目前檢測風疹常用ELISA法測定患者血清中的特異性風疹IgM抗體，該方法快速、靈敏，但是至少發(fā)病后5天才可以檢測到，并且容易引起假陽性反應[3]；細胞培養(yǎng)病毒分離法，用于臨床標本中風疹病毒檢測十分準確，但操作復雜、步驟繁瑣，需要的檢測時間長；傳統(tǒng)PCR方法雖簡便快捷，但存在不能定量，易交叉污染等缺點。近年出現(xiàn)的實時熒光定量PCR技術，融匯了PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性以及光譜技術的高精確定量等優(yōu)點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果，彌補了常規(guī)PCR易產(chǎn)生假陽性和不能定量兩大技術缺陷，避免了交叉污染，使其成為基礎研究和分子生物學診斷領域最熱門的技術之一[4]。

本研究建立了一種風疹病毒RNA Taqman實時熒光定量RT-PCR方法，并采用傳統(tǒng)PCR制備了與目的片段一樣的定量陽性參考標準品，可以保證目的片段與標準品的擴增效率一致[5]。采用本研究制備的標準品建立的標準回歸曲線(圖3)，線性相關系數(shù)r為-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，示不同稀釋度的標準品的自然對數(shù)值與相應的Ct值具有良好的相關性，證實了本研究建立的風疹病毒RNA Taqman實時熒光定量RT-PCR方法定量的高準確性。因此建立的風疹病毒RNA Taqman實時熒光定量RT-PCR方法具有簡便、快速、準確、定量的特性，將其運用于RV感染的早期臨床診斷，可為臨床風疹診斷與治療提供及時準確的依據(jù)，最大限度地降低育齡婦女風疹病毒感染率，最大限度地減少死胎、畸胎等的發(fā)生率，使優(yōu)生優(yōu)育工作更上一個臺階，進而提高全社會出生人口的素質(zhì)。

致謝：本研究得到了中山醫(yī)科大學達安基因公司的大力協(xié)助，在此表示衷心的感謝！

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