熒光原位雜交技術(shù)在檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞hTERC基因擴(kuò)增的應(yīng)用進(jìn)展

宋英君 王 霞 趙愛(ài)琳

(青島市立醫(yī)院婦科； 山東 青島 266000)

熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization， FISH)是分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的一項(xiàng)重要內(nèi)容[1],近十幾年來(lái)已從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究廣泛地轉(zhuǎn)向臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。本文就熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)子宮頸上皮細(xì)胞hTERC基因擴(kuò)增的臨床應(yīng)用做簡(jiǎn)要綜述。

1 背 景

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重地危害婦女身體健康。 根據(jù)我國(guó)有關(guān)權(quán)威部門最新流行病學(xué)調(diào)查，子宮頸癌及癌前病變的患病率高達(dá)萬(wàn)分之六十七，因此，進(jìn)行早期的篩查和診斷尤為必要。

早期診斷是治療宮頸癌及提高患者預(yù)后的有效手段。國(guó)際上通用的篩查宮頸癌的方法一般為宮頸細(xì)胞涂片形態(tài)檢查及HPV病毒檢測(cè)。細(xì)胞涂片檢查敏感性一般在55%～80%左右，但一旦觀察到異常特異性可達(dá)到90%以上。但在分級(jí)鑒別中人為的因素大，客觀性和準(zhǔn)確性不夠。HPV 檢測(cè)雖敏感性高，在84%～100%之間，但特異性一般只在64%～95%之間，并且90%的HPV陽(yáng)性的病人在兩年之內(nèi)可轉(zhuǎn)陰，并不會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。因而從宮頸癌篩查及早期診斷角度出發(fā)，迫切需要其他可靠指標(biāo)或手段來(lái)協(xié)助以上檢查，使結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠及更有預(yù)見(jiàn)性。

最近幾年，針對(duì)宮頸癌的研究表明，宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過(guò)程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增，其中涉及到的最重要的基因可能是人類染色體末端酶(hTERC)基因[2-3]，擴(kuò)增可阻止細(xì)胞的凋亡，因而可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，對(duì)hTERC基因擴(kuò)增的檢測(cè)有助于宮頸癌的篩查及早期診斷[4-9]，F(xiàn)ISH技術(shù)為檢測(cè)這一基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2 原 理

熒光原位雜交 (fluorescent in situ hybridization FISH)技術(shù)是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸雜交原理在細(xì)胞核中或染色體上顯示 DNA 序列位置的方法。FISH采用熒光標(biāo)記的DNA探針，根據(jù)探針與被檢測(cè)標(biāo)本中DNA序列的互補(bǔ)性，探針與樣本DNA雜交后，在熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光信號(hào)而得出結(jié)果。FISH技術(shù)本身操作相對(duì)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好、穩(wěn)定，并具有很高的靈敏性及特異性。因此FISH非常適用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)。

2.1 FISH 技術(shù)的探針類型

FISH 技術(shù)是將標(biāo)記的探針和待測(cè)序列雜交，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)及類型，達(dá)到診斷染色體病的目的[10-11]。 探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為 DNA、cDNA、cRNA 及合成寡核苷酸探針。用于雜交的探針包括5類：①染色體計(jì)數(shù)探針。主要指來(lái)自染色體著絲粒部位的特殊序列，如α衛(wèi)星 DNA 或染色體的特異片段 Y 染色體長(zhǎng)臂的異染質(zhì)區(qū)。②染色體位點(diǎn)特異探針。指針對(duì)某一染色體上單一 DNA 序列的探針， 例如診斷 Y 染色體性別決定區(qū)( sex determination region of Y chromosome，SRY) 基因的探針，可用來(lái)診斷染色體有無(wú)缺失、重復(fù)或診斷染色體微缺失綜合征。③全染色體涂抹探針(whole chromosome painting probes，WCP)這類探針特異地覆蓋特定的靶染色體，可用來(lái)診斷染色體的結(jié)構(gòu)異常，如缺失、插入、易位等。④專門研究端粒的探針。其與著絲粒探針 WCP 聯(lián)合也用于檢測(cè)染色體易位等。⑤為特異患者制作特殊探針成功跨越斷裂點(diǎn)全長(zhǎng)的探針，可用于篩查染色體臂間倒位及易位等。

2.2 FISH 技術(shù)的探針熒光標(biāo)記方法

FISH 技術(shù)的探針熒光標(biāo)記方法分為直接法及間接法。直接法用熒光素直接標(biāo)記特殊的探針，經(jīng)變性、雜交、漂洗后，可直接在熒光顯微鏡下檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)。 間接法則在雜交、漂洗之后，依抗原抗體反應(yīng)的原理，既將熒光素與探針結(jié)合，又將熒光素與其特異的抗體結(jié)合，將待測(cè)信號(hào)放大，從而得以檢測(cè)特異的靶序列。間接法放大作用強(qiáng)，對(duì)單一序列診斷的敏感性較高。目前從單色 FISH 發(fā)展到雙色 FISH乃至多色 FISH，已經(jīng)可以用不同的熒光素以不同比例混合得到多種顏色的探針，診斷人類的多條染色體有無(wú)變異。

3 應(yīng) 用

人類染色體端粒酶 RNA (hTERC)由 Feng等[12]于1995年首次從腎癌 293細(xì)胞系 cDNA文庫(kù)中篩選出。hTERC是合成端粒重復(fù)序列的模板,是端粒酶活性必需的核心組分之一。近年來(lái)研究顯示,宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變過(guò)程中,幾乎均伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增,其中所涉及最重要的基因可能為 hTERC基因。

Nakano[13]應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)宮頸不典型增生/化生、原位癌及浸潤(rùn)癌等高增殖活性組織中 hTERC基因,發(fā)現(xiàn)均伴有 hTERC原位雜交信號(hào)局灶性高表達(dá),提示 hTERC表達(dá)上調(diào)可能促使端粒酶激活,與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Wisman等[14]應(yīng)用原位雜交及逆轉(zhuǎn)錄 —聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN) Ⅰ～Ⅲ級(jí)、宮頸癌和正常宮頸組織標(biāo)本中 hTERC表達(dá),結(jié)果幾乎所有標(biāo)本都檢測(cè)出hTERC表達(dá),未證明 hTERC與宮頸病變的關(guān)系。2003年,Heselmeyer等[15]首次將熒光原位雜交 (FISH)技術(shù)成功應(yīng)用于宮頸細(xì)胞涂片檢測(cè) 3q26 hTERC基因。研究發(fā)現(xiàn),只有極少數(shù)正常、不典型增生 (ASC)和輕度上皮內(nèi)病變 (LSIL)標(biāo)本檢測(cè)到 hTERC擴(kuò)增,而 CIN Ⅱ中 hTERC擴(kuò)增者占 63%,CINⅢ中占 76%,四倍體細(xì)胞數(shù)和 hTERC表達(dá)水平隨病變嚴(yán)重程度增加,認(rèn)為 hTERC檢測(cè)可作為篩查高度上皮內(nèi)病變(HSIL)的獨(dú)立指標(biāo),有助于預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展情況。2年后 ,Heselmeyer等[16]再次應(yīng)用 FISH技術(shù)檢測(cè) hTERC基因,標(biāo)本取自隨訪 1～3 年中進(jìn)展至 CINⅢ的 CINⅠ/CINⅡ者 (進(jìn)展者 )、自愈的 CINⅠ/CINⅡ患者 (自愈者 )。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有進(jìn)展者都伴有hTERC擴(kuò)增,而自愈者無(wú)1例。值得注意的是,有 33%細(xì)胞學(xué)正常的標(biāo)本檢測(cè)到 hTERC擴(kuò)增,而這些患者歷經(jīng)短暫的潛伏期后被確診為 CINⅢ或浸潤(rùn)癌。提示hTERC檢測(cè)可早期診斷宮頸癌,預(yù)測(cè)病變進(jìn)展。FISH檢測(cè)可降低細(xì)胞學(xué)的假陰性率。

高危型 HPV感染已公認(rèn)是宮頸癌發(fā)病的首要因素,Hopman等[17]研究了宮頸病變中, hTERC表達(dá)及 HPV整合情況的關(guān)系。其將 FISH探針應(yīng)用于 CINⅡ/Ⅲ、微浸潤(rùn)癌及浸潤(rùn)癌標(biāo)本,檢測(cè) HPV病毒的物理狀態(tài)和 hTERC拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,隨病變進(jìn)展, hTERC拷貝數(shù)逐漸增加,而 hTERC擴(kuò)增標(biāo)本中,HPV也大部分被整合。從而認(rèn)為宮頸 HPV感染與 hTERC擴(kuò)增有關(guān),高危型 HPV的基因整合和 hTERC擴(kuò)增可能是宮頸 ASC向浸潤(rùn)癌發(fā)展的重要因素 ,但尚未得出HPV感染導(dǎo)致 hTERC表達(dá)上調(diào),從而使癌發(fā)生的結(jié)論。 Andersson等[18]也報(bào)道h TERC 基因在子宮頸腺癌的擴(kuò)增比例范圍為2.3～5.2， 平均比例為 3.3，hTERC 基因的檢測(cè)有助于子宮頸癌的早期篩查及診斷。

4 展 望

目前的研究已初步提示, hTERC基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定作用,但其具體機(jī)制尚不明確。hTERC對(duì)端粒酶活性至關(guān)重要,而端粒酶活性與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān),對(duì)抗 hTERC抑制端粒酶活性，有望成為宮頸癌治療的新手段。在宮頸癌潛伏期即可檢測(cè)到hTERC擴(kuò)增,因而 hTERC檢測(cè)可用于宮頸癌早期診斷,且 hTERC擴(kuò)增水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān),可用于預(yù)測(cè)病情進(jìn)展,并為選擇治療方法提供依據(jù),應(yīng)用 FISH法對(duì) hTERC進(jìn)行定性、定量分析將具有重要意義。

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